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PPSQ-30系列操作界面 PPSQ-30系列操作界面（２） 判定氨基酸序列方法 马肌红蛋白分析举例 - 色谱图 - 不能被判定的氨基酸 * 全自动蛋白质/多肽测序仪 PPSQ-30系列 岛津制作所　　 蛋白质 / 多肽测序仪 PPSQ-31A / 33A 蛋白质测序仪系统结构 计算机 打印机 艾德蒙反应部 分离色谱柱 试剂 PTH-氨基酸 洗脱液 检测器 输液泵 PPSQ-31A/33A-Edman Chemistry- 氨基酸测序分析流程图 固定样品 耦合反应 切割反应 抽提 转换反应 进样 分离、检测 数据分析 将蛋白质样品通过聚凝胺固定在玻璃纤维板、或者将转印有蛋白质斑点的PVDF膜放置在反应器中。 在TMA（R2）氛围中将蛋白质のN末端氨基与PITC（R1)相反应，生成PTC-蛋白质。 使用乙酸乙脂（S2)清洗多余的化学试剂及 生成的副产物。 以TFA（R3)将PTC-蛋白质N末端結合切 断，形成ATZ-氨基酸。 使用氯丁烷（S3)将游离的ATZ-氨基酸从 转换器中抽提出来。 艾德蒙降解 反应器 使用25%TFA溶液（R4) 将ATZ-氨基酸转换成稳定的PTH-氨基酸 由乙氰溶液（S4B)溶解的PTH-氨基酸，经进样器注入HPLC。 由反向液相色谱系统分离、检测PTH-氨基酸。 纪录、显示数据，判定PTH-氨基酸、计算定量、回收率等。 转换器 进样器 HPLC 数据处理 反应器 ? 转换器 -PPSQ-31A / 33A- PPSQ-30系列特长 ?操作简单（恒溶剂方式） ?低运行成本 ?数据处理 ?容易实现微量分析 PTH-氨基酸分析 PTH-氨基酸分析 (2) 洗脱各种PTH-氨基酸保留时间的重现性 制备样品 双向电泳 SDS电转印（PVDF膜） 　　　 ?亲和性色谱 ?离子交换 ?过滤 ?反向HPLC 脱盐 蛋白质测序仪 液相色谱—柱分离 ?通过前后色谱图比较发现PTH-氨基酸量 增减变化。 ?各种PTH-氨基酸的回收量是不均衡的： （低回收量的PTH-氨基酸有：Ser、Thr、His、 Arg、Cys、Trp） 10pmol抹香鲸肌红蛋白分析举例- 1 ～ 22 氨基酸- 根据相差色谱图进行氨基酸序列分析 500pmol马肌红蛋白分析举例 - 69 ～ 71 氨基酸- 运行试剂消耗量及成本 马肌红蛋白分析举例 -自动判定- 马肌红蛋白分析举例 -回收率曲线- 从大肠杆菌提取蛋白的双向电泳影像 电转印后序列分析　（Spot1） Cycle 4 Cycle 3 Cycle 2 Cycle 29 Cycle 28 Cycle 27 （１）磷酸化（Ser、Thr、Tyr　等） （２）被糖链修饰的（Asn、Thr、Ser　等) （３）双硫键结合（ Cys 不稳定） （４）其他氨基酸侧链的修饰 半胱氨酸的判定 进行还原烷基化处理 ?吡啶乙基化 ?羟甲基化　等 注意：所采用的系统可能造成与其他PTH-氨基酸洗脱时间相 重叠的情况。 S-吡啶乙基化反应流程图 Bu3P+H2O S Cys S Cys NH CH COO CH2 SH CH2 CH N NH CH COO CH2 S CH2CH2 N * * * * *