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血液样品预处理的标准操作
血液样品预处理的标准操作一、目的规范高效液相色谱分析中血液样品预处理的操作。二、职责1. 实验室分析测试人员对本规程的实施负责。2. 对于每一项具体的研究课题,具体的操作步骤应由实验室负责人负责制定,并由实验室分析测试人员严格实施。3. 实验室负责人负责对本规程的修订。三、血液样品预处理的标准操作(SOP)1. 实验仪器与设备的准备1.1 试管 一般采用有盖子和刻度的尖底试管,要求密封性好,编号清楚准确,并摆放整齐。1.2 EP管 一般采用的规格有1ml、1.5ml、2 ml。要求密封性好,编号清楚准确,并摆放整齐。1.3 移液器 要求定量准确,重复性好。1.4 其它 涡流混合器、离心机、真空泵、烧杯、量筒、记号笔、试管架、标签纸等。2. 样品的均匀化 2.1 将装有血浆(血清)样品的EP管放置在冰箱冷藏室内,缓慢解冻为血浆(血清)溶液。2.2 然后取出放置至室温,置涡流混合器上混匀或往复振摇亦可到达均匀的目的。3. 液-液提取 3.1 提取溶剂的准备 3.1.1 常用的溶剂有氯仿,二氯甲烷,乙酸乙酯,乙醚等。3.1.2 提取溶剂可以是一种也可以是几种溶剂的混合溶液,目的是调整提取溶液的剂性,既保证待测样品被充分萃取进入提取溶剂,同时又有很好的选择性。3.2 根据待测样品的需要用移液器定量吸取血浆(血清)至试管中,盖好试管塞。3.3 必要时调整血浆(血清)溶液的pH值,根据待测样品的性质加入酸、碱或缓冲溶液。3.4 用移液器定量吸取提取溶液至装有血浆(血清)的试管中,盖好试管塞。3.5 溶液的混匀 3.5.1涡流混匀 将试管置于涡流混合器上进行旋涡,并保证样品溶液旋涡充分混匀,旋涡时间一般为2-3分钟。3.5.2 摇床混匀 将试管置于摇床上往复振摇,振摇时间一般为5-10分钟。3.6 样品的离心 将试管置于离心机中,分离过程中一般采用3000-4000r/min。离心之前注意要平衡,加速时应注意缓慢逐步加速,以防加速过快试管炸裂,离心时间一般为15-20分钟。3.7 离心分离后试管中样品分为上下两层,用移液器吸取上层有机相,转移至另一试管中。3.8 溶剂的挥发 经过以上处理后得到的样品溶液,如果待测物的浓度在定量限以上,而且溶剂对HPLC系统没有干扰,就可以直接进样分析。但是在很多情况下需要除去溶剂,即浓缩甚至干燥样品。除溶剂时最重要的是不丢失或破坏待分析物质,同时还要考虑安全性和经济等。3.8.1 自然挥发 将样品溶液放置在室温下挥发,有时还可适当加热,加速溶液挥发。3.8.2 氮气吹干 氮气流能防止发生氧化,为了加快挥散速度,将样品溶液置于氮气流下吹干。3.8.3 减压蒸发 在密闭容器内,通过抽真空以降低液体表面的压力,使其沸点降低,样品溶液很快挥发,减少了蒸发过程中样品与空气的接触,避免由此引起的分解等副反应,适于热不稳定的样品。3.9 样品的复溶 用于样品溶液残渣复溶的溶液通常采用流动相或其它有机溶剂。用移液器准确定量吸取,并且复溶样品应充分混合均匀。3.10 预处理样品的储存 预处理后的样品应保存在冰箱冷藏室,样品应竖直放置、排列整齐、编号准确清楚。待样品进样分析以前取出,以保证样品的稳定。3.11 乳化现象3.11.1防止乳化 可增加有机溶剂的体积,避免猛烈振摇或加入适当的试剂改变其表面张力等方法防止乳化。3.11.2 破乳 若已发生严重的乳化现象,应采取适当的方法消除乳化。3.11.2.1 离心 可将试管置于离心机中离心消除乳化。3.11.2.2 冷冻 可将试管置于冰箱中冷冻消除乳化。3.11.2.3 加入电解质。3.11.2.4 加入适当的稀释液稀释。4. 去蛋白处理 4.1 有机溶剂的准备 甲醇与乙腈是反相液相色谱法中常用的蛋白沉淀剂,因为它们与流动相的组成相同。甲醇沉淀蛋白的优点是上清液清澈,沉淀为絮状易于分离;乙腈与之相反,产生细的蛋白沉淀,但沉淀效率较甲醇高。4.2 根据待测样品的需要用移液器定量吸取血浆(血清)至试管中,盖好试管塞。4.3 必要时调整血浆(血清)溶液的pH值,根据待测样品的性质加入酸、碱或缓冲溶液。4.4 用移液器定量吸取有机溶液至装有血浆(血清)的试管中,盖好试管塞。4.5 溶液的混匀 有机溶剂使蛋白质变性而析出沉淀,从而把与蛋白质结合的药物解离出来。与此同时待测样品大部分被萃取进入有机溶剂。4.5.1涡流混匀 将试管置于涡流混合器上进行旋涡,并保证样品溶液旋涡充分混匀,旋涡时间一般为2-3分钟。4.5.2 摇床混匀 将试管置于摇床上往复振摇,振摇时间一般为5-10分钟。4.6 离心去除蛋白 将试管置于离心机中,分离过程中一般采用
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