培训课件-分子杂交技术hu.ppt

7.4.2 非放射性探针的双重原位杂交方法 双重荧光探针原位杂交方法 （1）直接法 不同颜色的荧光素标记两种探针，直接与靶核酸在标本原位杂交，杂交信号能在荧光显微镜，流式细胞仪和激光共聚焦显微镜下进行检测。 优点：简便。缺点：敏感性低。 荧光双或多重杂交法多用于染色体，培养细胞和冰冻切片。常规石蜡切片的自发荧光强，一般不适于直接荧光原位杂交。 （2）间接法 用地高辛和生物素分别标记的不同探针、杂交后，用不同荧光素标记的地高辛抗体和抗生物素抗体或卵白素检测杂交体。 已有FITC(绿色)TRITC(红色)和AMCA(aminomethylcoumarin acetic acid)兰色荧光标记的抗体商品供应。 7.5 原位杂交的PCR增敏法 Bagasra及其同事在1990-1993年成功的报告了原位杂交和聚合酶链反应结合法，简称为原位杂交PCR(PCR in situ hibridisation, PCRISH)。 利用PCR技术将靶核酸片段扩增，然后做原位杂交，即用标记的核酸探针与扩增了的DNA进行杂交，显示和定位，其敏感性可达到显示单个拷贝基因信号的程度。 7.6 原位杂交的CSA增敏法 1989年，Bobrow等首次报道了催化信号放大法(catalyzed signal amplification, CSA)。 1992 年，Adams等将CSA法用于提高免疫组织化学的敏感性。 1995年，Kerstens等成功的将CSA法用原位杂交的增敏。适用于光镜或荧光显微镜的原位杂交的弱信号的放大。 * 近年来已发展了多色荧光技术，同时可用不同的探针来进行杂交。这种方法可用来进行染色体的基因定位，或观察组织中不同的 RNA的分布。果蝇早期的发育中，不同基因的控制就采用了这种方法进行研究。 * 这种方法常用来从基因文库（gene bank或gene library）中来钓基因。 * 尽管取得了上述重大进展，但分子杂交技术在临床实用中仍存在不少问题，必须提高检测单拷贝基因的敏感性，用非放射性物质代替放射性同位素标记探针以及简化实验操作和缩短杂交时间，这样，就需要在以下三方面着手研究：第一，完善非放射性标记探针；第二，靶序列和探针的扩增以及信号的放大；第三，发展简单的杂交方式，只有这样，才能使DNA探针实验做到简便、快速、低廉和安全。 * 一般来说DNA分子有其独特的限制性内切酶图谱，所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带。 * 时间短了，杂交反应不完成； 时间长了也无益，会引起非特异结合增多。 * 时间短了，杂交反应不完成； 时间长了也无益，会引起非特异结合增多。 * 差别杂交的技术基础十分简单，它不需要任何有关的目的基因的核苷酸序列信息，而重要的是耍拥有两种不同的细胞群体：在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。在这种情况下便可制备到两种不同的mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA种的总mRNA群体，其二是不含有目的基因mRNA种的总mRNA群体。因此，可以通过这两种总mRNA(或是它们的cDNA拷贝)为探针的平行杂交，对由表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。当使用存在目的基因的mRNA探针时，所有包含着重组体的菌落都呈阳性反应，在x光底片上呈现黑色斑点，而使用不存在目的基因的mRNA探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在x光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片井对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落，供作进一步研究使用。 * 应用差别杂交技术分离克隆的目的基因存在着诸多方面的局限性。首先，差别杂交的灵敏度比较低，特别是对于那些低丰度的mRNA而言，这个缺点就显得更加突出。这是因为在差别杂交中所使用的杂交探针是mRNA反转录成的cDNA群体。在这些同位素标记的探针中，真正能与目的基因核苷酸序列完全互补的仅占很低的比例，以至于那些低丰度的mRNA之cDNA克隆，是很难用此法检测出来的。其次，差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑或克隆片段，因此是十分耗费时间和金钱的工作。况且两套平行转移的滤膜之间，DNA的保有量往往是有差别的，这样所得的杂交信号的强度也就不会一致，需要重新进行点杂交，以作进一步的阳性克隆鉴定工作。所以说重复性差是差别杂交筛选法的又一个缺点。 扣除杂交技术在理论上很具吸引力,但实际操作并不容易：首先是回收cDNA量有限,并仍存在重复性差,敏感度低的缺点,这些均限制了这一技术更广泛的使用。 * （1）将Tester cDNA均分两份，分别接上接头1 (adaptor 1)和接头2 (adaptor 2)。接头设计上，adaptor由一长链(40nt)和一短链(10nt)组成的一端是平端的双链DNA片段