- 1、本文档共107页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
植物基因的同源克隆
陈桂信
福建农林大学园艺学院;植物基因同源克隆的原理;;植物基因同源克隆的策略;2. 植物总RNA的提取与纯化
逆转录
cDNA
保守区引物设计
PCR扩增 构建cDNA文库
保守区cDNA片段
设计RACE引物
5/-RACE 3/-RACE cDNA文库筛选
基因的cDNA全长
;植物基因组DNA的提取与纯化 1.CTAB法:提取缓冲液为 100mM Tris-HCl(pH8.0)1.4M NaCl, 20mMEDTA (pH8.0),2%(W/V) CTAB。 2.SDS法:提取缓冲液为 100-200mM Tris-HCl(pH8.0), 0.25- 0.5MNaCl,25-50mM EDTA(pH8.0),0.5-2.0%(W/V) SDS(单独加)。;植物DNA的提取方法;
植物DNA提取的必经步骤;1.破碎细胞壁:液氮研磨。
2.裂解细胞:CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromige,十六烷基三甲基溴化铵)或SDS(Sodium Dodecyl Sulfate,十二烷基磺酸钠)—裂解膜结构,EDTA—螯合核酸酶中的Mg2+,65℃保温30-60min —钝化内源核酸酶。
3.去除多酚类、多糖等次生物质。
4.去除蛋白质:用酚、酚与氯仿(1:1)、氯仿与异戊醇(24:1)抽提;5MKAc(pH7.5)沉淀蛋白质;蛋白酶K水解蛋白质。
5.沉淀核酸:0.6-1.0倍体积冰冷的异丙醇;2倍体积的无水乙醇;70%乙醇—清洗沉淀中的无机离子。
6.除RNA:用RNase消化;用LiCl沉淀RNA。
7.浓缩DNA:0.1倍体积3MNaAc(pH5.2)和2倍体积无水乙醇沉淀。
8.溶解DNA沉淀:0.1或1×TE(pH8.0)或无菌双蒸水。;植物DNA提取的难点;多酚、多糖与其它次生物质的去除;1.材料的选择与处理:新鲜、幼嫩—嫩芽、嫩叶、幼苗;叶片的饥饿处理:4℃黑暗处理1-2天,消耗淀粉和多糖。在研磨后用-20℃预冷的丙酮抽提2次。
2.在细胞裂解之前分离细胞核(两步法)除多糖和多酚:研磨:破坏细胞壁,释放果胶类多糖细胞器与核膜保持完整 加入核分离缓冲液(不含去垢剂)混匀 低速离心去上清(多糖、酚类) 加入含去垢剂的核裂解液。
3.调整提取缓冲液的组成除多糖和多酚:NaCl:浓度为0.7M时,RNA与DNA溶于CTAB,而多糖不溶解,CTAB与多糖和残留的蛋白质形成复合物,通过氯仿或酚抽提停留在界面上,容易去除;浓度为0.4M时,核酸沉淀。CTAB:常用2.0%,多糖含量高的可提高至3.0%。pH值:通常为8.0,低pH(5.5)能避免酚类
您可能关注的文档
最近下载
- 2024保密知识考试题库含答案(最新).docx
- 2019-2020学年广东省广州市天河区高一(下)期末物理试卷(附答案详解).docx VIP
- Excel电子表格导入科怡档案管理软件操作说明.doc
- 高中物理动量练习题(含解析).docx VIP
- 2021-2022学年广东省广州市天河区高一(下)期末物理试卷(附答案详解).pdf VIP
- 动量及动量守恒定律练习题.pdf VIP
- 2022-2023学年广东省广州市天河区高一(下)期末物理试卷(附答案详解).docx VIP
- 15D503 利用建筑物金属体做防雷及接地装置安装.pptx
- 新建学校及附属工程勘察设计施工EPC总承包项目技术标(实施计划、技术、管理组织方案).docx
- 争做合格的高中生.pptx
文档评论(0)