《植物原生质体融合技术》.ppt

固体培养法 原生质体按照一定细胞起始密度，均匀分布于薄层固体培养基中 此法优点有利于对单个原生质体的胞壁再生和对细胞团形成的全过程进行定点观察 浅层液体培养法： 在培养皿或三角瓶中注入3~4ml原生质体培养液，然后将纯净的原生质体，按一定的细胞密度注入并进行培养 双层培养法 在固体培养基上，加入适宜原生质体胞壁再生和细胞分裂的液体培养基 1、原生质体的培养方法 2、原生质体的培养程序 细胞壁再生： 体积膨大，叶绿体重新排列，新的细胞壁开始合成，细胞由球形变成椭圆形。 细胞分裂形成细胞团： 一般在培养2-3天后细胞质增加，细胞器增殖，DNA、蛋白质等合成增加，细胞分裂，形成小的细胞团，发育成愈伤组织或胚状体。 器官形成植株再生： 从愈伤组织诱导发生 胚状体发育 3、原生质体培养成功的技术关键 原生质体的活力 影响因素：制备原生质体的方法，渗透压稳定剂种类、浓度，质膜稳定剂种类、浓度，温度和保温时间 原生质体密度 起始密度一般为104-105 个/mL 细胞壁再生速度 植物种类和取材的生理状态；培养细胞所处的时期；酶解时所用质膜稳定剂种类 原生质体培养的营养和环境 培养基 原生质体培养的环境：光照、温度、湿度 第16章 植物原生质体融合技术 Plant Protoplast Fusion 植物原生质体的制备 植物原生质体的培养 植物原生质体的融合 回顾：动物细胞融合技术简介 ◆亲本的来源 ◆融合方法 ◆融合细胞的筛选 ◆融合细胞的克隆 ◆融合细胞的鉴定 三、植物原生质体的融合 1、植物细胞融合的概念和意义 2、植物细胞融合的程序 3、诱导细胞融合的方法及融合剂 4、细胞融合的影响因素 5、细胞杂种的选择和鉴定 1、植物细胞融合的概念和意义 细胞融合(cell fusion)概念： 又称细胞杂交(cell hybridizaion)：离体条件下用人工的方法把不同的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。 细胞融合的意义： 克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍 为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件 2、植物细胞融合的程序 ◆ 原生质体分离的分离、纯化 ◆ 融合方法选择 ◆ 杂种细胞的筛选 ◆愈伤组织形成器官分化植株再生 ◆杂种植物的鉴定 3、诱导原生质体融合的方法及融合剂 ◆ 盐类融合法 ◆ 高Ca2+和高pH值融合 ◆ 聚乙二醇（PEG）融合法 ◆ PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法 ◆ 电融合法 回顾：诱导动物细胞融合的方法 1、病毒诱导细胞融合 2、化学融合剂诱导细胞融合 3、电融合法 A. 盐类融合法 盐类融合剂种类 硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3) 2 氯化物类：NaCl、CaCl 2 、Mg Cl 2 、 BaCl 2 葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠 盐类融合的优缺点 优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小 缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发融合 B. 高Ca2+和高pH值融合 Ca2+浓度 0.05 mol/L pH 9.5-10.5 具体做法(以烟草为例) 取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的比例混合; 加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇; 再用甘氨酸钠缓冲pH值到10.5，成为融合液，同时在37℃下保温0.5h; 用0.4mol/L甘露醇洗净高CaCl2和高pH值； 两种原生质体的融合率达到10%。 C. 聚乙二醇（PEG）融合法 Polyethylene glycol(PEG)是一种多聚化合物,分子式H(OHCH2-CH2)nOH, 平均相对分子量200-20000之间 融合机制：可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着结合 用相对分子质量为1540的PEG处理40-50 min；再用培养液缓慢稀释PEG最后洗去PEG，得到10%的异核体 D. PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法 先用PEG处理30min；（PEG是相邻原生质体表面间的分子桥） 然后用高Ca2+和高pH值液，稀释PEG；（引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布，从而促进了融合） 再用培养液洗去高Ca2+和高pH值 PEG诱导原生质体融合过程 E. 电融合法 原理： 改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。 优点： 对原生质体的损害小，融合率高，重复性强；装置精巧、方便简单，可在显微镜下观察或录像融合过程，免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。 电融合基本过程 将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微电极型只有一个小室，平行