多聚酶链式反应极好.ppt

关于多聚酶链式反应极好1．概念：PCR即_______________，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_____为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。多聚酶链式反应DNA遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆DNA序列测定。2、PCR技术的应用第2页,共24页，2024年2月25日，星期天一、基础知识（一）回忆DNA的复制回答相关问题1、发生时间：发生在细胞有丝分裂的间期和减数第一次分裂间期。2、特点(方式)：边解旋边复制半保留复制多起点复制3、合成条件模板：原料：游离的脱氧核苷酸DNA两条链能量：ATP酶:解旋酶、DNA聚合酶反应条件温和4、场所：细胞核(主)、线粒体、叶绿体第3页,共24页，2024年2月25日，星期天DNA母链：提供复制的模板解旋酶：打开DNA双链4种脱氧核苷酸：合成子链的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子链ATP：为复制过程提供能量引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸（二）DNA复制的条件第4页,共24页，2024年2月25日，星期天12345脱氧核苷酸结构1．DNA的平面结构：第5页,共24页，2024年2月25日，星期天OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基脱氧核糖磷酸基团碱基脱氧核糖碱基脱氧核糖5’3’磷酸二酯键DNA3’端，5’端指什么。DNA的羟基(-OH)末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。脱氧核苷酸链结构第6页,共24页，2024年2月25日，星期天目录上页下页习题参考书返回ATGCATGC5，端含磷酸基团3，端含羟基3，端5，端第7页,共24页，2024年2月25日，星期天目录上页下页习题参考书返回DNA聚合酶的特性---专一性DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。第8页,共24页，2024年2月25日，星期天观察图2复制的方向：2方向：子链的5’端向3’端延伸。第9页,共24页，2024年2月25日，星期天第10页,共24页，2024年2月25日，星期天（1）、DNA分子的热变性原理DNA双链单链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）变性的目的：解开双链:解开氢键在80~100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为2、PCR原理变性第11页,共24页，2024年2月25日，星期天高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。（2）、TaqDNA聚合酶的应用第12页,共24页，2024年2月25日，星期天（3）、PCR反应的条件①DNA模板；②分别与两条模板链相结合的两种引物（引物Ⅰ和引物Ⅱ）；③四种脱氧核苷酸；④耐高温的聚合酶（TaqDNA聚合酶）；⑤控制温度，但不需解旋酶；⑥需要在一定的缓冲液中进行。PCR反应需要的这些条件的原因是什么？第13页,共24页，2024年2月25日，星期天1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸高温变性低温复性重复1~3步30轮（1）、步骤：变性——复性——延伸二、PCR的反应过程第14页,共24页，2024年2月25日，星期天5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ变性95oC复性55oC延伸72oC5/3/3/5/第15页,共24页，2024年2月25日，星期天5?引物15?引物2第二次复制第一次复制5?5?5?5?5?5?模板DNA5?5?5?5?5?5?5?5?25～30次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。第16页,共24页，2024年2月25日，星期天2、PCR的反应结果①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。第17页,共24页，2024年2月25日，星期天三、PCR反应的实验操作1、PCR仪设备及用具2、微量离心管一种薄