基因工程酶学基础.ppt

PstⅠBamHⅠHindⅢSalⅠXbaⅠEcoRIBamHI???XbaISalIBamHIHindⅢPstⅠEcoRIEcoRI第95页,共102页，2024年2月25日，星期天方案设计：片段1，加SalⅠ和PstⅠ酶头，载体用SalⅠ和PstⅠ片段2，加SalⅠ和EcoRⅠ酶头，中间载体用SalⅠ和EcoRⅠ片段3，加SalⅠ，中间载体用SalⅠ单切片段2，加XbaⅠ和EcoRⅠ酶头，载体用XbaⅠ和EcoRⅠ片段3，加SalⅠ和XbaⅠ酶头，中间载体用SalⅠ和XbaⅠ片段1，加SalⅠ，中间载体用SalⅠ单切片段3，加SalⅠ和XbaⅠ酶头，载体用SalⅠ和XbaⅠ片段1，加SalⅠ和HindⅢ(PstⅠ)酶头，中间载体用加SalⅠ和HindⅢ(PstⅠ)片段2，加SalⅠ，中间载体用SalⅠ单切第96页,共102页，2024年2月25日，星期天方案设计：PstⅠBamHⅠHindⅢSalⅠXbaⅠEcoRI片段1，加SalⅠ和KpnⅠ酶头，载体用SalⅠ和KpnⅠ片段2，加SalⅠ和EcoRⅠ酶头，中间载体用SalⅠ和EcoRⅠ片段3，加KpnⅠ和SalⅠ，中间载体用KpnⅠ和SalⅠPstⅠKpnⅠSalⅠEcoRI第97页,共102页，2024年2月25日，星期天PstⅠBamHⅠHindⅢSalⅠXbaⅠEcoRIBamHI???XbaISalIBamHIHindⅢPstⅠEcoRIEcoRI第98页,共102页，2024年2月25日，星期天方案设计：片段2，加SalⅠ和BglⅡ酶头，载体用SalⅠ和BamHⅠ片段1，加SalⅠ和EcoRⅠ酶头，中间载体用SalⅠ和EcoRⅠ片段3，加SalⅠ，中间载体用SalⅠ单切PstⅠBamHⅠHindⅢSalⅠXbaⅠEcoRIEcoRISalⅠKpnⅠPstⅠ第99页,共102页，2024年2月25日，星期天第100页,共102页，2024年2月25日，星期天TheEnd!第101页,共102页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第102页,共102页，2024年2月25日，星期天*十年后，搞清了细菌的限制与修饰分子机理，由三个基因位点所控制：限制性内切酶；限制性甲基化酶；控制两个系统的表达。M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使DNA免受EcoRI的切割*限制性内切酶一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。*Star活性是内切酶的一种普遍现象，但是大多数可以控制，正常情况下使用提供的缓冲液就不会出现Star活性。*从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。相同的分子末端间存在竞争，形成不同构型的DNA分子（自身环化、线形多聚体、环化多聚体以及重组质粒）。分子越小、浓度越低越容易形成自身环化；另要注意载体与目的DNA浓度之比。4.DNA片段末端类型与浓度插入片段：载体=3:1增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。单酶切产物连接比例需要更高。第63页,共102页，2024年2月25日，星期天从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。6、平头双链DNA片段的连接操作提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200mM第64页,共102页，2024年2月25日，星期天7、DNA连接的反应体系DNA+vector3:1ligase0.5-1UH2Oupto10-20ulligasebuffer第65页,共102页，2024年2月25日，星期天第三节DNA聚合酶1、基因工程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow聚合酶、TaqDNA聚合酶T7DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、逆转录酶第66页,共102页，2024年2月25日，星期天1）共同特点把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端，催化核苷酸聚合，合成与模板互补的DNA序列2）