转录共激活因子OBF-1调节p300表达的初步研究.pdfVIP

《现代免疫学}2009年 29卷第 6期 转录共激活因子 OBF一1调节 p300表达的初步研究 陈艳 ，孙 健 (上海交通大学医学 院 上海市免疫学研究所 ，上海 200025) 摘要 ：OBF一1是淋巴细胞特异性转录共激活因子 ，其蛋 白主要有 2种异构体分别为 p34和 p35。为观察 OBF一1对 p300基 因 表达的影响，分离OBF一1 小鼠的脾脏单个核细胞及B细胞 ，采用 RTPCR及 Westernblot方法分别检测 p300mRNA和蛋 白水平 。构建小鼠OBF一1(p34)表达质粒和 p300报告基因质粒 。在 293T细胞 中过表达 p34，检测 p34对 内源性 p300蛋 白 表达的影响。将 p34表达质粒和 p300报告基 因质粒共 同转染 293T细胞 ，通过荧光素酶报告基 因方法检测 p34对 p300基因 启动子转录活性 的影 响。结果 ：与来源于 OBF-1 ～小 鼠的脾脏单个核细胞相 比，来源于 OBF-1 小 鼠的单个核细胞 中 p300表达无论是 mRNA还是蛋 白水平均明显降低 。分析显示 ，OBF一1(p34)能够促进 p300基 因转录及蛋 白表达 。这些结果 提示 ，OBF一1正调 p300转录及表达 。 关键词 ：转录共激活因子 OBF1；p34；转录共激活因子 p300；B淋 巴细胞 ；转录 中图分类号 ：R392．11 文献标识码 ：A 文章编号 ：1001—2478(2009 OBF一1(又称为 BoB．1或 OCA—B)是一个 富含 除小 鼠分析了p300的表达以及可能的机制 。 脯氨酸的淋巴细胞特异性转录共激活 因子 ，它通过 1 材料与方法 与 Octl或 Oct2的 POU 结构域 以及 DNA上保守 序列八聚体octamer元件共同作用形成三聚体复合 1．1 材料 0BF_j基 因敲除小 鼠由瑞士 巴塞 尔 物 ，促进基因转录l1]。体外实验证 明，OBF一1作 FMI生物医学研究所 Matthias博士惠赠 。C57BL／ 为转录共激活因子明显促进免疫球蛋 白的转录 ]。 6小 鼠，购 自上 海斯莱克实验 动物有 限公 司。 OBF一1 小 鼠的次级淋巴组织 (淋 巴结和脾脏)中无 pFLAG—CMVTM_4、OVA、Alum 购 自 Sigma公 生发中心形成_7]，抗原依赖的B细胞发育受到影 司。pGL3一Basic购 自Promega公司。293T细胞购 响，TD抗原的免疫应答减弱。此外 ，OBF 小 自中国科 学院细胞库 。DMEM 培养基 由Hyelone 鼠脾脏中的不成熟 B细胞数量减少，边缘 区B细 公司生产。BCellIsolationKit购 白MiltenyiBio— 胞严重减少口。‘。OBF1基因主要编码 2种异构 tee公 司。TRIzol、Lipofectamine 2000试 剂 由 型蛋白，根据分子量不 同分别命名为 p34和 P40。 Invitrogen公司生产。RIPA、BCA 蛋 白定量试剂 p34位于胞核内，可通过与 POU家族 的 Oct蛋 白 盒购 自Pierce公司。KOD Plus为 TOYOBO公 司 结合而发挥作用。P40位于胞浆中，可被蛋 白水解 产品。ImProm—IITM 反转录试剂 、荧光素酶检测 酶降解为 p35，p35位于胞膜内侧 ，在 BCR刺激下 试剂 由Promega公 司生产 。限制性 内切酶均来 自 离开胞膜进入细胞核，与Oct蛋 白结合调节基因的 Fermentas公司。PCR产物 回收试剂盒和胶回收试 转录 j。 剂盒 由Qiagen生产。anti— 为 JacksonLab生产 。 p300是一种具有 乙酰转移酶活性 的转录共激 兔抗