生物催化剂的修饰与改造.ppt

第八章 生物催化剂的修饰与改造 酶蛋白分子水平的改造 基于序列的合理化设计（sequential rational design）,如化学修饰、定点突变（site-directed mutagenesis） 非合理设计（irrational design），利用基因的可操作性，模拟自然界的演化进程。如定向进化（directed evolution ）杂合进化（hybrid evolution） 酶分子的研究：认识、改造和应用 认识酶:利用各种生物化学、晶体学、光谱学等方法对天然酶或突变体进行研究，获得酶分子特征、空间结构、结构和功能之间的关系，以及氨基酸残基功能的信息。 改造酶： （1）合理设计：以酶分子结构特征为根据，对酶分子进行改造。 （2）非合理设计：不需要准确的酶分子结构信息，而通过随即突变、基因重组、定向筛选等对酶进行改造。 生物催化剂的化学修饰 酶分子修饰：酶蛋白分子的结构发生改变改变酶的某些特性和功能。 广义的说：蛋白质的修饰，通过化学基团的引入或除去—改变蛋白质的共价结构。 酶分子的完整空间结构两面性： 赋予酶的生物催化功能和特性， 导致酶的稳定性差、活性不高。 酶分子的修饰目的 人为的改变天然酶的某些性质：创造天然酶所不具备的某些优良特性，扩大酶的应用范围。 1）提高生物活性、 2）增强在不良环境中的稳定性， 3）新的催化能力。 4）研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 如：脂肪酶和蛋白酶被MPEG修饰后，可溶于有机溶剂，催化酯合成、酯交换、肽合成。 如：a-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的-NHCH2COOH后，抗不可逆热失活的稳定性在60C可提高1000倍。 如：对脂肪酶的CRL的非特异性化学修饰，大幅度提高立体选择性。 什么是酶分子修饰？ 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。 酶蛋白修饰的方法 大分子结合修饰 小分子修饰 大分子修饰剂的化学修饰（共价和非共价） 非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。 一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。 另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍； 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍 小分子修饰剂的化学修饰 小分子化合物对活性部位或活性部位之外的侧链基团化学修饰。 方法： 酶分子的表面化学修饰、内部修饰、 酶分子非催化活性基团修饰、 酶分子催化活性基团的修饰、 酶蛋白的主链修饰、 辅因子相关的修饰。 酶修饰后的性质变化 热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。 抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。 各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。 半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。 最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。 Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。 酶蛋白修饰的方法 物理修饰 化学修饰 主链修饰 侧链基团修饰 金属离子置换修饰 组成单位置换修饰 定点突变 酶分子的物理修饰 通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。 酶蛋白的固定化方法修饰 固定化可通过空间障碍、分配或扩散限制等效应影响酶的稳定性。 空间障碍使得其他大分子难于与酶作用，载体上的酶能抵抗蛋白水解酶的降解，固定化后也能抑制某些化学失活。 固定化后，微环境和游离酶有所改变，影响最始pH、底物专一性和动力学常数。如阳离子resin载体，最适pH