血型B抗原模拟多肽%2fFas重组腺病毒对小鼠4T1乳腺癌影响实验的研究.pdf

血型B抗原模拟多肽／Fas重组腺病毒对小 鼠4T1乳腺癌影响的实验研究 硕士研究生姜兆静 指导教师张积仁 摘要 研究背景 机体的免疫系统具有控制肿瘤发生发展的能力，是肿瘤研究中最古老的概 念之一。其中肿瘤微环境的免疫状态在肿瘤发生学及治疗方面又具有至关重要 的作用。随着科学技术和方法学的进步，越来越多的肿瘤抗原被鉴定出来。研 究者发现，虽然很多肿瘤抗原的免疫原性不弱，而且抗原提呈细胞可迅速呈递 大多数肿瘤抗原，肿瘤患者体内也确实存在针对肿瘤抗原所产生的免疫应答， 但相关免疫应答产物并不能产生有效的抗肿瘤效应。当前多数免疫治疗方法均 能够增强患者全身的免疫功能，但抗瘤效果却与预期的相差很多。原因主要在 于肿瘤患者免疫功能状态并不能直接反应机体的抗肿瘤免疫效应，即使患者全 身免疫功能得到改善，肿瘤微环境内的免疫效应却仍处于抑制状态。肿瘤微环 境是肿瘤细胞发生发展过程中所处的内环境，由肿瘤细胞本身、间质细胞、微 血管、组织液及少量浸润细胞，如树突状细胞、巨噬细胞等共同组成。作为肿 瘤免疫效应阶段的执行场所，肿瘤微环境内存在多种因素均与局部免疫抑制状 态的产生有关，并形成TIJ中瘤局部微环境中特有免疫模式。肿瘤细胞不仅逃避 免疫系统的攻击，同时也抑制其生长环境中的免疫细胞的正常功能。这些因素 为开辟新的肿瘤免疫治疗方案提供了思路。 随着分子生物医学的发展，免疫治疗作为肿瘤第四种治疗模式．生物治疗的 重要组成部分，在肿瘤治疗中的地位和作用日趋重要。逆转肿瘤微环境的免疫 摘要 抑制状态是当前肿瘤免疫治疗的难题与突破点。 研究目的 应用健康成人B型血全血腹腔注射免疫BALB／c小鼠使其体内产生抗血型 型中瘤内注射血型B抗原模拟多肽／Fas重组腺病毒，测定其在肿瘤组织中的表 达情况，观察其对人红细胞悬液免疫后的小鼠肿瘤生长的抑制作用及对生存期 的影响；测定瘤内注射重组病毒后小鼠肿瘤微环境淋巴细胞、TNF．a、IFN吖、 IL．2、微血管密度等免疫功能指标，判定其对肿瘤微环境免疫抑制状态的逆转 作用。 实验方法 1将健康成人全血稀释成不同浓度红细胞悬液，腹腔注射免疫BALB／c小 鼠，每次0．2ml，2次／周，免疫后3天、7天、14天、21天、28天，分别测定 小鼠体内产生抗血型抗原B抗体效价，择优选择最适宜的红细胞悬液免疫浓度， 分析抗体产生的趋势，为后续试验做准备； 2无菌环境下培养4TI-孚L腺癌细胞，至对数生长期，制备细胞悬液(浓度为 106／m1)，小鼠乳腺脂肪垫区皮下注射上述浓度4T1乳腺癌细胞0．2ml。7天左右， 肿瘤长至lcmT左右大小，选取肿瘤无出血坏死的小鼠进一步实验； 3选取肿瘤大小相近、肿瘤无出血坏死的18只荷瘤小鼠，随机分3组，分别 2．21 鼠，取出肿瘤组织，应用westernblot方法测定B／Fas在肿瘤组织中的表达情况。 量、免疫组织化学法检测CD34表达，并判定其对肿瘤微环境免疫抑制状态的逆 转作用； 436只荷瘤小鼠，分三组，每组12只，每组随机取5只小鼠应用游标卡尺测 量三组小鼠肿瘤长径a和垂直宽径b，比较注射前、注射后3天、7天、14天三组 硕士学位论文 小鼠肿瘤体积变化，并观察所有荷瘤小鼠的生存期，设定观察期限为60天。肿 瘤体积计算方法如下： axb2。观察不同处理对小鼠肿瘤生长的抑制 V(cm3)=1／2 作用及对生存期的影响。 5统计方法 (1)计量资料结果以均数士标准差表示； (2)不同分组不同时间抗血型抗原B抗体效价、目的蛋白B／Fas的表达量 灰度值、肿瘤体积比较应用SPSS13．0统计软件包采用重复测量数据的方差分 析比较，不同时间点各处理组间抗血型抗原B抗体效价、目的蛋白B／Fas的表 达量灰度值、肿瘤体积、肿瘤内淋巴细胞亚群、细胞因子的测定、肿瘤内微血 管密度比较应用SPSS ANOVA方法分析及组间比 13．0统计软件包采用one—way 较采用LSD法，如方差不齐则选择近似F检验We