基因重组和基因工程.ppt

************************************左下角处有超级链接到配伍末端******************1、显微注射法(Microinjectiontechnique)在显微镜下，用一根极细的玻璃针（直径1-2微米）直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。用这种方法生产的动物约有10%是整合外源基因的转基因动物。第96页,共126页，2024年2月25日，星期天2、电穿孔法在高压电场的短暂作用下，细胞膜上可出现可逆的孔洞，外源DNA可通过此孔洞进入胞内。方法适应不同细胞如细菌、酵母、植物及动物细胞。需电穿孔仪。第97页,共126页，2024年2月25日，星期天3、DNA-磷酸钙共沉淀法将DNA与CaCl溶液混合，再缓慢滴加入含有磷酸的HEPES溶液中，形成DNA-磷酸钙共沉淀颗粒。小心地将颗粒加入到培养的靶细胞表面，保温数小时后，使DNA被靶细胞摄取。更换培养液使外源DNA在细胞中表达，筛选转化细胞或分析外源基因的表达量。第98页,共126页，2024年2月25日，星期天4、DEAE-右旋糖苷法该法先用来促进病毒DNA导入，后来发展为一种哺乳动物细胞的基因转移方法。方法：用外源DNA和DEAE-右旋糖酶的混合物处理细胞。通常只用于克隆化基因的瞬间表达，不用于细胞的稳定转化。它对BSC-1，CV-1和COS细胞转染较好，因此应用上有限制。第99页,共126页，2024年2月25日，星期天5、逆转录病毒载体逆转录病毒是一种RNA病毒，基因大小为3-10kb。不同于其它病毒，它具有二倍体基因，即含有两个相同的RNA分子，有典型的真核mRNA结构（包括帽子和尾巴）。第100页,共126页，2024年2月25日，星期天1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法:原位杂交、Southern印迹等。2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选第101页,共126页，2024年2月25日，星期天(插入失活法)抗药性标记选择带有双抗生素的质粒自身环化在两种抗生素培养基上都生长，DNA重组体只能在其中一种抗生素培养基上生长。第102页,共126页，2024年2月25日，星期天组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救第103页,共126页，2024年2月25日，星期天α互补原理筛选重组体pUC18如果无外源基因插入：则质粒lacZ基因正常表达和宿主菌的lacZ基因互补，产生有活性的β–半乳糖苷酶，经IPTG诱导后，分解X-gal底物，产生blueclony。如果有外源基因插入：则质粒编码的lacZ基因失活、菌体不可能互补产生β–半乳糖苷酶，产生whiteclony。第104页,共126页，2024年2月25日，星期天原位杂交第105页,共126页，2024年2月25日，星期天Southern印迹第106页,共126页，2024年2月25日，星期天鸡的β肌球蛋白的克隆和检出免疫学方法第107页,共126页，2024年2月25日，星期天重组DNA技术操作过程可形象归纳为：小结分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体细胞筛筛选重组体第108页,共126页，2024年2月25日，星期天重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交第109页,共126页，2024年2月25日，星期天表达体系的建立：表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达第110页,共126页，2024年2月25日，星期天标准：选择标志 强启动子翻译调控序列 多接头克隆位点E.coli表达体系的不足：不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体；很难表达大量可溶性蛋白。1.原核表达体系(E.coli表达体系最常用)第111页,