第11章 离心技术.ppt

Enter presentation date 第11章 离心技术 Test 基本原理和计算泳 离心运动 线速度 转速 相对离心力 沉降速度 重力场中的沉降速度 第二节 离心设备及其用途 根据转速和用途分类 低速离心机 :最大转速6000 rpm左右，最大相对离心力近6000×g，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离。可用水平转头，角度转头 ，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。 按结构分类 一般在高速和低速离心机根据结构和功能进行分类，品种繁多，各厂家命名也无统一标准。可分为台式离心机、多管微量台式离心机、细胞涂片离心机、血液洗涤台 式离心机、高速冷冻离心机、大容量低速冷冻离心机、低速冷冻离心机、台式高速冷冻离心机、台式低速自动平衡离心机等。 ⑵ 荡平式转头、甩平转子（Siwing-Bucket-Rotor） 这种转头有4或6个自由活动的吊桶（离心套管），当转头静止时，吊桶垂直悬挂，当转头转速达到每分钟200到800转时，吊桶荡至水平位置，这种转头最适合做密度梯度区带离心 （3）垂直转头 其离心管垂直放置，样品颗粒的沉降距离短，离心所需时间也短，适用于密度梯度区带离心，离心开始时和结束时液面和样品区带要作九十度转向，因而降速要慢。 离心管 离心管主要用塑料和不锈钢制成： 塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能较好。 塑料离心管的优点是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。 不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。 第三节 超离心技术——制备型超速离心 沉降系数 单位离心加速度的沉降速度 ； ，合并了； ，单位秒（s），颗粒直径d很小，所以s也很小，一般以10-13为一个基本单位，S表示，1S=10-13s。 正、反、平衡点。 沉降系数与物质颗粒的大小、形状、密度、介质的密度黏度相关，对于给定的温度和溶剂，s是微粒物质的特性常数。 11.3.1 离心分离方法的选择 差速离心法： 差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法所得的沉淀是不均一的，仍杂有其它成分，需经过2-3次的再悬浮和再离心，才能得到较纯的颗粒。 此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒，其优点是：操作简易，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：须多次离心，沉淀中有夹带，分离效果差，不能一次得到纯颗粒，沉淀于管底的颗粒受挤压，容易变性失活。 可用角式、水平式转头 密度梯度离心： 离心后在近旋转轴处（r1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（r2）介质的密度最大，但样品中粒子的最小密度必须大于最大介质密度，即 ＞ρ。 这种方法是根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。 此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更大）或相对分子质量相差3倍的蛋白质。大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。 由 ＞ρ可知S＞0，因此该离心法的离心时间要严格控制，既有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任一粒子达到离心管底之前。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。 离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1.28 kg/cm3和60％。 注意点： ①严格控制离心时间 ②粒子密度大于介质密度 ③样品事先配制在较平缓的连续密度的梯度溶液 ④不能用角式转头、只能用水平式转头  此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是用于分离大小相异而密度相似的物质。 等密度离心： ①离心时间要长 ②可用角式转头或水平式转头 ③粒子密度相近或相等时不宜用 ④密度梯度溶液中要包含所有粒子密度 ⑤不能用刹车 等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝CSCl，其密度可达1.7 g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。 收集区带的方法有许多种: