第八章PCR技术及应用.ppt

第八章PCR技术及应用 第八章 PCR技术及应用第一节 PCR技术概述PCR: 聚合酶链式反应 （ Polymerase Chain Reaction），是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-复性-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。 1985年，美国Cetus公司和加利福尼亚大学联合创建的一种DNA的体外扩增技术，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。 1989年Science 评选的十大科技进展之首，并于1993年获得诺贝尔奖。 第三节 影响PCR的主要因素 PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下 ： 反向PCR步骤 1、先用限制性内切酶酶切样品DNA， 2、然后用DNA连接酶连接成一个环状 DNA分子， 3、通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段； 第五节 PCR应用领域 PCR技术使分子生物学及相关学科发生了一次方法学的革命。在不到10年的时间内，在以下几个领域中PCR技术已具有实用价值，且其应用范围正在不断扩大中。 1．遗传病的产前诊断 用胎儿羊膜细胞，羊水或甚至母血可以检查胎儿的性别，这在与性染色体关联遗传病诊断中是必要的。对于高发的遗传病，如地中海贫血、镰刀状细胞贫血、凝血因子缺乏、DMD等已在临床应用多年，为优生优育作了贡献。 2、遗传倾向的疾病 对于有遗传倾向的疾病尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂症、甚至肿瘤中的一部分，均是当前研究的重点，近期内可望有突破。 3．致病病原体的检测 入侵的病原体外源基因，一旦阐明其部分核酸序列，就可以设计引物或探针，用PCR、PT-PCR或杂交方法来检测，其范围包括细菌、病毒、原虫及寄生虫、霉菌、立克次体、衣原体和支原体等一切微生物。 PCR诊断的特点是可以选择其基因中的保守区作通用检测，也可以选定差异较大的基因部位作分型检测。既可以做一病原体的专用检测，也可以将有关病毒、细菌中不同的品种作一次多元检测。 PCR检测的灵敏度和特异性都远高于当前的免疫学方法，所需时间也已达到临床要求，这对于难于培养的病毒（乙肝），细菌（如结核、厌氧菌）和原虫（如梅毒螺旋体）等来说尤为适用。 4．癌基因的检测和诊断 虽然对癌基因的研究大部分还属于基础阶段，但癌变是由基因变异所导致的这一基本事实已无庸置疑，所以癌基因、抗癌基因的研究，离开分子水平的诊断手段是无法进行的。 临床上已可应用的例子有白血病残留细胞的定量（包括慢粒和急粒），肺癌中P53及Rb等抗癌基因的失活，神经质瘤N-myc基因的激活和表达。通过原位杂交观察特定癌基因及抗转移基因的植入和反义寡核苷酸对强表达癌基因的阻断均已成为近代基因治疗的着眼点。 5．DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证 这一为公、检、法部分所瞩目的课题已经在某些国家取得法律认可。肌红蛋白小卫星基因，β-珠蛋白基因、ApoB基因等的多肽性和重复次数的差异都被应用于鉴定，其灵敏度已达到一根头发、一个细胞、一个精子取得个体特征图谱，这一领域也已发展到骨髓或脏器移植配型及动物种系的研究中。 6．动、植物检疫　 灵敏、特异、快速诊断检测方法是我国进出口口岸的门卫，检查出入国门的人员、动、植物（种畜、种籽）等是否携带烈性传染病（艾滋、动物病毒、植物病毒等）病原体，食品、饲料等是否带沙门氏菌等均需要基因诊断手段将这些病菌拒之于国门之外，是提高我国综合国力的必要保证。 7．高科技生物医学领域中的应用 1）生成克隆DNA中的特异序列作为探针； 2）通过选择性扩增特定DNA区段，生成某些未克隆化基因的特异性探针；好处：可用根据已知氨基酸序列设计的一套简并寡核苷酸引物生成与该基因序列完全一致的DNA片段 3）由少量mRNA生成cDNA文库； 4）生成大量的DNA以进行序列测定或直接用PCR测序； 5）定点突变与突变的鉴定；扩增产物大小 – 鉴定插入或缺失； 核苷酸竞争引导(Competitive nucleotide priming) – 两个引物， 分别用不同荧光标记，PCR后检测产物的种类或比例。 6）染色体缓移(Chromosome Crawling) 用于扩增靶序列两侧的未确定DNA片段 — 反向PCR。 五、反向PCR Invers