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组织化学技术教程 第一章???? 绪论 组织化学（histochemistry）是运用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术，对组织与细胞的化学成分、化学反应及其变化规律进行定性、定位和定量研究的科学，是介于这些学科之间的一门边缘科学。组织化学自出现以来，已取得了长足的发展。这与相关学科的发展是分不开的，其中细胞生物学、生物化学以及分子生物学是组织化学形成和发展的基础。 一、组织化学发展简史 Klebs(1868)和H. Stuve1872)用愈创木酯酊同脓作用产生蓝色证明组织中有过氧化物酶的存在；P.Ehrlich(1885) 发现了细胞色素氧化酶；R. Heidenhain(1868) 指出动质（ergastoplasm）—核糖核酸是一种嗜硷性物质，可被醋酸沉淀；F. Miescher(1873)利用甲绿对核染色质的选择性亲和力，分离出核染色质。 自A. Bencke(1862)将苯氨染料用于组织学领域，许多研究者在组织中应用了染色反应，相继各种蛋白质被染色出来。到19世纪末，胶原蛋白染色，脂肪的苏丹Ⅲ染色以及组织中金属盐类的显色等技术方法得到发展。但是由于化学知识的贫乏和显微镜技术的停滞在一定时期限制了组织化学的发展。 20世纪30年代，随着生物化学的发展和电子显微镜技术的应用，组织化学迎来了复兴时代。自从E. Takamatsu（高松英雄）和G. Gomori 1939年同时证明了硷性磷酸酶的组织化学方法，以后的30年间，酶组织化学得到了飞速发展，高松证明了磷酰胺酶、ATP酶；Gomori设计了酸性磷酸酶、脂酶、酯酶等组织化学证明法。 此间，金属盐法，硫化钴法，偶氮色素法，偶氮色素四唑盐法（tetrazolium salts method）以及磷酸化酶组织化学证明法等相继问世。特别是H. Scheldon和D. Brandes等人把电镜与酶组织化学结合起来，以金属沉淀法观察了酸性磷酸酶和硷性磷酸酶，奠定了电镜酶组织化学（electron microscope enzyme histochemistry）基础。后来A. M. Seligman(1967)提出锇黑化法（Osmification method）进一步阐述了电镜组织化学的基本原理和反应过程。 1950年A. H. Coons等人提出了荧光抗体法，从而把免疫学引入组织化学实验中，后来P. K. Nakane，S. Avrameas 和L. A. Sternberger等人以辣根过氧化物酶为标记物对酶进行观察，创立了酶标抗体法，从而为组织化学开辟了新途径。 随着分子生物学的发展，1969年人们把分子杂交技术应用到组织切片和细胞标本上，开始探索原位杂交技术，经过30年不断应用、完善和发展，特别是探针制备与标记物两大关键技术的突破，目前原位杂交技术已广泛应用于遗传学、病毒学、神经内分泌学、病理学、免疫学和发育生物学等各个领域，显示出巨大的应用潜力。 现代组织化学已经渗透和应用于生命科学的许多学科，经过近几十年的发展，产生了许多分支，如核酸与核蛋白、蛋白质与氨基酸、脂类与脂蛋白、碳水化合物与粘蛋白及粘多糖、无机物组织化学、酶组织化学电镜组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、同工酶组织化学、定量组织化学、原位杂交组织化学和放射自显影技术等。总之，现代组织化学的概念已经远远超过了原有范围，无论从理论、内容、技术手段、研究范围都比过去更广泛、更深入。 二、组织化学技术的基本要求 1．尽可能地保持组织和细胞生前的形态结构、化学成分和酶的活性。为此必须选择适当的固定液和恰当的处理方法，如冷冻干燥、冰冻替代、恒冷箱切片、振动切片等。 2．化学反应要求在细胞或组织内进行，须有定位的准确性。为此必须控制反应的时间和条件，使反应的产物不移位，不弥散。 3．反应物须有显色性和定量的可能性，即必须 是有色的沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、 色深、不溶，并能保留在原位上。颜色深度 要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关 系。 4．反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研 究和验证。 5．反应物有灵敏性和特异性,以利于对比观察。 6．反应产物有对照，否则难以判断其结果的可 靠性。 第二章 组织化学基本理论 组织化学是运用物理和化学的原理、技术研究组织与细胞内的化学成分及其反应，对这些化学成分进行定性、定位及其定量并研究其变化规律的科学。它是介于组织学、细胞学与生物化学之间的一门边缘科学。人们对生物组织的研究沿着两条主要途径发展：一条途径是对显微镜下可分辨的越