HBV LAM耐药突变多重荧光定量方法的建立及初步应用.doc

  HBV LAM耐药突变多重荧光定量方法的建 立及初步应用# 唐景峰1，李卫2，周康平1，王业富1** 5 10 15 20 25 30 35 40 （1. 武汉大学生命科学学院，武汉 430072； 2. 湖北省产品质量监督检验研究院，武汉 430061） 摘要：根据 HBV LAM 耐药突变位点，选择目前公认的且突变频率最高的 rtL180M、rtM204I/V， 设计 AllgloTM 探针及相关引物，构建重组质粒作为荧光定量 PCR 的标准品。优化荧光定量 PCR（FQ-PCR）反应条件和体系，建立了可同时检测 rtL180M、rtM204I/V 荧光定量 PCR 方法， 并对所建体系进行方法学评价。结果显示该方法有很好的灵敏度和重复性。对阳性标本检测 均呈阳性，对非目标菌检测均呈阴性。应用该方法对 60 例临床标本进行考核，结果与基因 测序法一致。该方法的建立对快速检测乙肝耐药有重大意义。 关键词：医学微生物学；乙型肝炎病毒；AllgloTM 探针；LAM 耐药；rtL180M、rtM204I/V； 荧光定量 PCR 中图分类号：Q939.93 The establishment and preliminary application of fq-pcr mehtods for the detection of HBV of LAM resistance mutation Tang Jingfeng1, Li Wei2, Zhou Kangping1, Wang Yefu1 (1. Wuhan University School of Life Sciences, WuHan 430072; 2. Hubei Province Product Quality Supervision and Inspection Institute, WuHan 430061) Abstract: Based on HBV of LAM resistance mutation sites, select the currently recognized as the highes tmutation frequency rtL180M, rtM204I / V, design AllgloTM probe and relevant primers, construct the recombinant plasmid as a quantitative PCR standard. Optimize the fluorescent quantitative PCR conditions and reactions, establish the simultaneous detection of rtL180M and rtM204I/V fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR) method, and evaluate the method. The results show that the method has good sensitivity and reproducibility.The results of the detection show the positive specimens are positive, and others are negative.Application of this method for assessment of 60 cases of clinical specimens, the results are same with gene sequencing.The establishment of the method is important for the fast detection of HBV resistance. Keywords: Medical Microbiology; HBV(Hepatitis B virus); AllgloTM probe; LAM resistance; rtL180M、rtM204I/V; FQ-PCR 0 引言 HBV 可引起急性肝炎和慢性肝炎，随着患病时间延长，可进一步发展成为肝硬化、原 发性肝癌和终末期肝功能衰竭。拉米夫定（lamivudine, LAM）是一种治疗乙型肝炎的胞嘧 啶核苷类似物，在 HBV 的治疗上有着广泛的应用，然而 HBV 对 LAM 的耐药性是一个普遍 棘手的问题，很多患者在服用 LAM 后半年即开始出现 HBV 耐药株[1-2]。随着服药时间的延 长，耐药率明显增加。研究表明，LAM 耐药的突变位点有：rtL180M、rtM204I/V/S、rtV173L、 rtV