细菌内毒素检测--中检员培训.ppt

2003年3月23日 培训内容 细菌內毒素检测 旋光仪操作 紫外分光光度计操作 滴定 装量检查 可见异物 PH值 第一部分：细菌内毒素检测 实验物品 鲎试剂（注意灵敏度） BET用水（细菌内毒素检查用水） 细菌内毒素工作标准品 水浴锅（调节温度37±1℃） 消毒酒精棉球（手部消毒和安瓿切口消毒） 玻璃注射器 干燥箱（灭菌用） 实验方法--凝胶法 凝胶法原理 1 鲎试剂灵敏度复核 鲎试剂是一种有生物活性的试剂，其稳定性受多种因素的影响，细菌内毒素检查法自药典收载以来，每版都有明确规定：每个实验室在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验，其意义在于：①验证鲎试剂灵敏度是否准确；②考查实验室条件；③考察实验人员操作技能；④验证细菌内毒素标准品的效价是否准确。因此为了保证细菌内毒素检查法的准确可靠性，检验人员应对每批新购入的鲎试剂进行灵敏度的复核。 这个是质检中心相关人员的实验内容。 2 细菌内毒素标准品 细菌内毒素工作标准品效价误差或效价不稳定，可影响实验结果，应标定细菌内毒素工作标准品的效价。细菌内毒素标准品溶解后一定要在旋涡混合器上混合15 min，以后每一步稀释要至少混合30 s。如不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高，阳性对照不凝等不正确的实验结果。 这个是质检中心相关人员的实验内容。 3 细菌内毒素检查用水（BET水） BET水是一种特殊的灭菌注射用水，它不仅是要求细菌内毒素含量小于0.015 EU/ml（凝胶法），而且要求有严格的pH值（6.0～8.0）范围 。 4 玻璃注射器处理 1ml玻璃注射器 12#不锈钢针头（20 ℃ 下一滴水的体积是0.025ml，4滴为0.1ml） 灭菌温度（180℃ 2小时以上）（250 ℃ 1小时以上） 灭菌温度是等到干燥箱到达指定温度才开始计时的。 鲎试剂选择 我们公司都是使用0.1ml规格的鲎试剂。包装规格2ml安瓿瓶 我们公司鲎试剂的灵敏度有0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、3个规格 车间中检室规定用0.25EU/ml的鲎试剂来做检查。（不要拿错了） 氨基酸有用0.125EU/ml 具体如下： 标准0.5EU/ml有：氯化钠注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖氯化钠注射液、复方氯化钠注射液、氧氟沙星注射液、17AA-I、苦参碱氯化钠注射液、利巴韦林葡萄糖注射液、右旋糖酐葡萄糖注射液、 标准0.35EU/mg 甲硝唑注射液（经过计算） 标准0.25EU/g 甘露醇注射液（经过计算） 标准0.125EU/ml有：18AA-Ⅱ、18AA-Ⅰ、 18AA、盐酸克林霉素氯化钠注射液、乳酸环丙沙星氯化钠注射液、15AA、乳酸左氧氟沙星注射液、18AA-Ⅳ、18AA-Ⅴ、果糖二磷酸钠注射液、18AA-Ⅲ、诺氟沙星葡萄糖注射液、氟康唑氯化钠注射液、曲可芦丁氯化钠注射液、氟罗沙星葡萄糖注射液、3AA、6AA、9AA、氨基酸注射液、17AA、小儿18AA-Ⅰ、 批生产记录写偏差时候没必要每个品种都写内毒素。 热原的测定方法 热原的分析、测定方法主要有： 鲎试剂法和家兔法 热原(progon) 医院临床在使用药品注射剂时，常有发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、肤色灰白、休克、严重时导致死亡，这种症状称为热原反应。 细菌内毒素（Endotoxin） 细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质 热原的优缺点 家兔热原检查法的优点，可在规定时间里观察到家兔的体温变化，相应反应了热原质引起哺乳类动物复杂的体温反应过程。所以，在半个多世纪以来热原检查法，为保障药品质量和用药安全发挥了重要作用。 但随着制药工业的发展和临床用药的要求，该方法的局限性越来越明显。这种热原检查法，只局限于某种药物进入体内（血循环）是否能引起体温变化或热原反应作为判断药品是否污染热原的方法，已不能满足医药工业发展的需要。其缺点： ①标准化程度低，无法判断检查样品中存在的热原质到底是什么或是哪一种物质。 ②由于试验动物家兔是处在被细菌污染的环境中，通过吸入或皮肤感染细菌内毒素而被免疫，导致动物的个体差异较大。 ③试验动物受到药品的药理活性干扰，而影响体温变化（如放射性药品、抗生素、生物制品等），实验结果难以判断。 ④设备及实验费用昂贵（如建设动物房、水电、动物饲料等耗费），做一种药品需要几百元/次，而鲎试剂仅几十元/次。 综上情况分析，鲎试验法可避免以上动物热原检查法的不足，该技术的成功和应用真可谓是药品质