3-氨基苯硼酸纸片法检测大肠埃希菌高产AmpC 酶的探讨.pdfVIP

1156 Tianjin Med J,Dec 2011, Vol 39 No 12 doi:10.3969/j.issn.0253-9896.2011.12.022 3-氨基苯硼酸纸片法检测大肠埃希菌高产AmpC酶的探讨* 李 静 胡志东 田 彬 徐海茹 李 金 关键词 大肠杆菌 β内酰胺酶类 纸片扩散抗菌试验 聚合酶链反应 微生物敏感性试验 AmpC酶又称诱导酶，属于Bush分类中的 Ⅰ类酶及分子 1.3.3 三维试验 参照文献[3]进行，以阴沟肠杆菌O29M作 生物学中的C类酶[1]。AmpC酶多数由染色体介导，部分呈诱 为产AmpC酶的阳性对照,以肺炎克雷伯菌ATCC700603为 导型表达。近年也陆续发现了质粒介导AmpC酶，其耐药基 阴性对照。（1）粗提酶液制备（冻融裂解法）：将质控菌和待检 因可在同种或不同种属细菌间广泛传播，使细菌耐药日趋复 菌密涂于1/4MH琼脂平板（平板直径为90mm）上，35℃孵箱 杂，给临床治疗提出了严峻的挑战，迫切需要临床实验室能 培养24h后，用灭菌棉棒取下全部菌苔于1mL灭菌生理盐水 快速而准确地检测产AmpC酶的细菌。目前临床实验室标准 中（用1.5mL离心管），置-70℃低温冰箱反复冻融5次。然 化委员会（CLSI）尚未确定检测的标准方法，本研究以三维试 后，在4℃条件下，10000r/min离心15min，抽取上清液即为 验和聚合酶链反应（PCR）为参照，与3-氨基苯硼酸（APB）双 粗提酶液。（2）三维试验：将0.5麦氏单位大肠埃希菌ATCC 纸片协同法进行比较，以评价APB双纸片协同法用于临床实 25922菌液均匀涂布于MH平板上，取FOX纸片（30μg/片）置 验室检测临床分离的大肠埃希菌的可靠性。 于平板中央，使用刀片在离纸片边缘5mm处放射状由里向 外切割一道狭缝，用微量加样器取30μL酶粗提液由里向外 1 材料与方法 加入狭缝内，酶液切勿溢出狭缝，将MH平板放入35℃孵箱 1.1 菌株来源 收集2010年1月—10月天津医科大学总医 过夜。若狭缝与抑菌圈处出现扩大的长菌区，则视为三维试 院住院患者各类送检标本（包括痰、尿、血、胸水、腹水等），经 验阳性，见图1。 常规方法进行细菌分离，用Compact全自动微生物分析仪鉴 定，选取无重复分离大肠埃希菌44株进行研究。大肠埃希菌 ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌 ATCC700603购自卫生部临检中心。阴沟肠杆菌O29M（染 色体介导，AmpC酶持续高产株）、ACT-1质粒介导AmpC酶 APB 大肠埃希菌由北京协和医院检验科惠赠。 1.2 主要试剂与仪器 头孢西丁（FOX，30 μg）、头孢他啶 （CAZ，30 μg）、头孢噻肟（CTX，30 μg）购自北京天坛药物生 a 物技术开发公司，水解酪蛋白（MH）琼脂粉购自上海伊华医 学科技有限公司，APB干粉购自Sigma公司。DNAMarker、 弱阳性 PCR扩增试剂购于北京全式金生物技术有限公司，VITEK-2 compact全自动微生物系统及鉴定卡、药敏试验卡购自法国 阳 阴性 生物梅里埃公司，9700 型DNA扩增仪为美国PerkinElmer 性 对照 公司产品，GelDoc2000凝胶成像系统仪为美国B