人LIGHT基因转染细胞的构建及鼠抗人LIGHT单克隆抗体的研制.pdfVIP

人LIGHT基因转染细胞的构建及鼠抗人LIGHT单克睫抗体的研制 中文摘要 人LIGHT基因转染细胞的构建及鼠抗人LIGHT单 克隆抗体的研制 一 中文摘要 13异源 三聚体结合同一个受体LT昼R，与LTo结合同一个受体HVEM，与FasL结合同一 活化的PBL、CD8+肿瘤浸润淋巴细胞、粒细胞和单核细胞均有高表达，但不表达于 胸腺组织．一些研究结果表明，L10}盯可以促进肿瘤细胞凋亡，也可以促进淋巴细 胞细胞活化，这都依赖于靶细胞表达的受体．研究显示，LIGHT是不依赖于CD28 的可诱导型表达的共刺激分子，可有效地协同CD3信号促进T细胞的增殖，同时它 也可以促进DC成熟，提高Dc对抗原的提呈能力；体外实验发现，可溶性LIGHT 分子可使一些恶性肿瘤生长减缓甚至可以诱导细胞凋亡。因此，可溶性和膜型LIGHT 与其受体形成的信号网络在免疫应答和抗肿瘤免疫中有重要的作用。 1人LIGHT基因的克隆 由此，为人LIGHT基因转染细胞的构建奠定了物质基础。 2人LIGHT基因转染细胞的构建 通过基因克隆技术，将人LIGHT全长的cDNA片段插入逆转录病毒载体 外长期传代和液氮反复冻存复苏，基因转染细胞生长良好，LIGHT的表达稳定在95％ 人lIGHT基因转染细胞的构建及鼠抗人LIGHT单克降抗体的研制 中文摘要 以上。 3 L929，LIGlllr基因转染细胞对T细胞的共刺激作用 将人外周血T细胞加入包被有抗人CD3激发型单抗的24孔或96孔板中，丝裂 组相比能显著地促进T细胞增殖。ELISA法检’坝《培养上清细胞因子的分泌，结果显 示基因转染细胞L929／LIGHT能显著促进人外周血T细胞分泌IF7,1．y。 4分泌鼠抗人LIGHT单抗的杂交瘤细胞株的制备 用已建立的基因转染细胞为免疫原，免疫BALB允小鼠，采用B淋巴细胞杂交 瘤技术，将免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓细胞SP2／0进行细胞融合，以上述基因 转染细胞为阳性筛选细胞，以转质粒的对照细胞L929／moek作为阴性对照细胞，经 免疫荧光标记分析及抗体分泌阳性孔内杂交瘤细胞的反复筛选，并经多次克隆化培 养，最终获得4株持续，稳定分泌鼠抗人LIGHT单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名 它均为IgGl；轻链均为K．经体外连续培养半年以上，液氮冻存后复苏，细胞的生 长状态良好，分泌抗体的性能稳定． 继而采用本室建立的腹水诱生和纯化方案，腹水形成阳性率为95％以上，腹水 的产量平均为5．0ml／只小鼠．经ProteinG亲和层析柱分离纯化，腹水型单抗纯化后 II X 间接免疫荧光分析的用量为0．2~2g，l 104细胞。 5鼠抗人LIGHT单克隆抗体对LIGHT膜分子的识别 western 况，结果显示四株单抗均可以在蛋白水平上与LIGHT分子结合。利用已纯化的单抗 间接免疫荧光法检测肿瘤细胞株上LIGHT分子的表达，结果表明大部分肿瘤细胞株 不表达，而乳腺癌、肺癌的一些细胞株表达LIGHT分子． 6四株抗LIGHT单克隆抗体识别不同的抗原位点 为了检测四株单抗识别LIGHT分子的表位，分别用生物素标记四株单抗，两两 比较结合位点的异同。流式细胞术检测结果发现四株单抗识别抗原位点各不相同。 Il 人LIGHT基因转染细胞的构建及鼠抗人LIGHT单克隆抗体的研制 中文摘要 这为研究LIGHT的生物学特性和制备LIGHTELISA试制盒奠定了物质基础。 7 T细胞和DCLIGIrr分子表达的生物学特性分析 活化和DC分化过程中的表达显示，LIGHT在T细胞活化过程中呈暂时性表达，而 导成熟而表达下调。 8两株单克隆抗体2G4、2All阻断LIGHT信号介导的协同刺激作用 在基因转染细胞协同激发型CD3mAb刺激T细胞增殖实验基础上，加入2G4、 2All单抗，结果显示这两株单克隆抗体可部分阻断T细胞经由基因转染细胞协同 步研究LIGHT信号介导的生物学功能奠定了基础。