猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB的原核表达及其单克隆抗体的研制.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（９）：２７～３１ 猪脑心肌炎病毒非结构蛋白３ＡＢ的原核 表达及其单克隆抗体的研制  沈　芳　姜　平 　李玉峰　李军星　王海燕 （南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室　南京　２１００９５） 摘要　目的：利用原核表达系统表达猪脑心肌炎病毒 （ＥＭＣＶ）非结构蛋白３ＡＢ，并通过杂交瘤细 胞技术制备其单克隆抗体，为相关研究工作奠定基础。方法：利用大肠杆菌系统表达具有良好抗 原性的重组３ＡＢ蛋白，经包涵体纯化后免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合， 间接ＥＬＩＳＡ筛选阳性的杂交瘤细胞，并结合免疫荧光（ＩＦＡ）和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ对抗体的特异性进行 鉴定。结果：经间接ＥＬＩＳＡ筛选阳性的杂交瘤细胞，获得 １株能稳定分泌抗３ＡＢ蛋白抗体的杂 交瘤细胞株，将其命名为２Ｄ１２，其亚类测定为ＩｇＧ１／。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和间接免疫荧光试验证明该 κ 单抗能特异性识别３ＡＢ蛋白。结论：成功获得了针对ＥＭＣＶ３ＡＢ的特异性单抗，为进一步研究猪 ? 脑心肌炎病毒非结构蛋白３ＡＢ的结构与功能及临床诊断试剂的研发奠定必要的物质基础。 关键词　脑心肌炎病毒　非结构蛋白　原核表达　单克隆抗体 中图分类号　Ｑ７８９ 　　脑心肌炎病毒（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓｖｉｒｕｓ，ＥＭＣＶ） 白的单克隆抗体，并对其生物学特性进行了鉴定。为 是近年来我国新出现的一种重要病原，可以引起猪和 进一步研究ＥＭＣＶ３ＡＢ的结构与功能、建立特异敏感 某些哺乳动物（如啮齿动物和灵长类动物）以脑炎、心 的ＥＭＣＶ检测方法奠定必要的物质基础。 肌炎或心肌周围炎为主要特征的一种急性传染病。 １　材料与方法 ＥＭＣＶ是微ＲＮＡ病毒科心病毒属成员，只有一个血清 型。ＥＭＣＶ的非结构蛋白包括２Ａ，２Ｂ，２Ｃ，２Ｄ，３Ａ，３Ｂ １．１　材料与试剂 ［１］ 以及蛋白酶３Ｃ和ＲＮＡ依赖性聚合酶 ３Ｄ 。非结构 　　含ＥＭＣＶ３ＡＢＣ全基因组的ｐＵＣ１８ＥＭＣＶ质粒由 ? 蛋白在病毒复制及其蛋白加工过程中发挥着重要作 农业部青岛动物检疫研究所王君玮提供；大肠杆菌 用。其中３Ａ（分子量为 １０ｋＤａ）是一个核芯蛋白；３Ｂ ＢＬ２１、质粒ｐＧＥＸ６Ｐ１和ＳＰ２／０骨髓瘤细胞由本实验 ? ? （分子量为２ｋＤａ）即ＶＰｇ，主要参与病毒的正链和负链 室保存；６～８周龄的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠购自扬州大学实验 ＲＮＡ合成的启动工程，其基因序列富含基本的亲水性 动物中心；重组３ＡＢ杆状病毒为作者制备并已鉴定；羊 ［２，３］ 氨基酸 。微ＲＮＡ病毒科的口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）也 抗鼠ＩｇＧ荧光抗体购自博士得生物工程公司；抗体亚型 含有非结构蛋白３ＡＢ，许多研究证明３ＡＢＥＬＩＳＡ方法 鉴定试剂盒购自Ｒｏｃｈｅ公司；ＥＣＬ化学发光试剂盒购 能有效检测 ＦＭＤＶ自然感染水平，同时可区别疫苗免 自ＰＩＥＲＣＥ公司；ＲＰＭＩ１６４０培养基购自ＧＩＢＣＯ公司； ［４～６］ 疫与自然感染 。但在ＥＭＣＶ研究方面尚无类似的 ＨＡＴ、ＨＴ培养基、聚乙二醇（ＰＥＧ４０００）购自Ｓｉｇｍａ公 报道。本研究采用原核表达系统，获得重组３ＡＢ蛋白， 司；预染蛋白质Ｍａｒｋｅｒ等其它生化试剂均购自宝生物 并通过细胞融合技术，获得了一株