可诱导表达hBMP-2慢病毒载体构建及其在.pdfVIP

482 Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, April 2011, Vol. 25, No.4 · · 可诱导表达hBMP-2 的慢病毒载体构建及其在 人脐血间充质干细胞中的表达 1 2 1 3 4 1 5 周明 石新艳 田少奇 王丽 张积华 孙康 邢士超 1 1 6 孙伟雪 黄洪杰 吴丹 【摘  要】    目的 构建可诱导表达hBMP-2 的慢病毒载体，并研究hBMP-2 在人脐血间充质干细胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells ，HUMSCs ）中的可诱导性表达。  方法 以pcDNA-hBMP-2 为模板，通过 PCR 反应获取hBMP-2 ，运用GATEWAY 技术构建pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2 、pLV/EXPN2-Puro-EF1A- 反向反式激 活因子（reverse transactivator ，rtTA ），通过PCR 鉴定重组慢病毒载体构建。将重组慢病毒与辅助质粒共同转染293FT 细 胞，包装成能表达hBMP-2 的可控性慢病毒，并测定病毒滴度。用病毒转染HUMSCs ，使用强力霉素进行诱导，分别在相 同诱导时间（48 h ）不同诱导浓度（0、10、100 ng/mL，1、10、100 μg/mL）及不同诱导时间（12、24 、48 、72 h ）相同诱导浓度 （10 μg/mL ）两种情况下用ELISA 法测定hBMP-2 的表达情况。对转染前后的HUMSCs 进行成骨诱导，用茜素红染色法 观察矿化物结节形成情况。  结果 成功构建了携带hBMP-2 的可控性慢病毒载体pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2 、pLV/ 8 7 EXPN2-Puro-EF1A-rtTA ，并获得相应的病毒，病毒滴度分别为3.5 × 10 TU/mL 和9.5 × 10 TU/mL ；病毒转染HUMSCs 后， HUMSCs 可通过强力霉素的诱导可控性表达hBMP-2 。在相同诱导时间情况下，强力霉素10 μg/mL 时诱导表达最强；而 在相同诱导浓度下，hBMP-2 的表达在诱导48 h 达峰值。HUMSCs 成骨诱导培养2 周后，茜素红染色示胞浆中有大量红 色的钙化基质沉积。  结论 通过GATEWAY 技术可以建立携带hBMP-2 目的基因的可控性慢病毒载体，为进一步研究 hBMP-2 诱导HUMSCs 成骨分化治疗骨坏死模型奠定实验基础，并提供了一种新的实验思路。 【关键词】 可诱导慢病毒载体 hBMP-2 Tet-on 系统 人脐血间充质干细胞 强力霉素 CONSTRUCTION OF INDUCIBLE LENTIVIRAL VECTOR CONTAINING HUMAN BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 2 GENE AND ITS EXPRESSION IN HUMAN UMBILICAL CORD BLOOD MESENCHYMAL STEM 1 2 1 3 4