猪肺泡巨噬细胞的分离、纯化和冷冻保存研究.pdfVIP

一 198一 江苏农业科学 2012年第40卷第11期 孟春花，曹少先，苏 磊，等．猪肺泡臣噬细胞的分离、纯化和冷冻保存研究[J]．江苏农业科学，2012，40(11)：198—201 猪肺泡巨噬细胞的分离、纯化和冷冻保存研究 孟春花，曹少先，苏 磊，贺 强，王慧利，丰秀静，张庆晓，刘铁铮 (江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏南京21oo14) 摘要：通过冷PBS气管灌洗法分离猪肺泡巨噬细胞(porcinealveolarmacrophages，PAM)，优化了PAM的纯化和冷 冻保存方法，并进行了PAM纯度鉴定、细胞吞噬功能和存活率检测。结果表明：RPMI一1640培养液比DMEM培养液 更适于PAM的培养和冷冻保存；巨噬细胞抗体MAC387免疫荧光检测表明，贴壁2h后更换培养液获得的PAM纯度 最高(P0．05)；用70％RPMI一1640+20％新生牛血清 +10％DMSO的体系冷冻保存细胞密度为 1×10个／mL的 PAM可获得高达98．09％的存活率，冻存前后PAM的墨汁吞噬率无显著差异(P0．05)。 关键词：肺泡巨噬细胞；纯化；冷冻保存；吞噬；猪 中图分类号：s828．1 文献标志码：A 文章编号：1002—1302(2012)11—0198—03 巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细 1 材料与方法 胞免疫和分子免疫学的重要对象。肺泡 巨噬细胞 (alveolar macrophages，AM)是机体抵御外来微生物侵袭肺脏的第 1道 1．1 材料 防线，不仅具有吞噬和抗原提呈功能，还能分泌多种生长因 1．1．1 试验材料 从南京天环食品(集团)有限公司屠宰场 子、前列腺素、白介素、补体、肿瘤坏死因子等调节和启动免疫 选取外观质地均匀、颜色粉红、无结节、无暗区或苍白区的新 炎性反应，一直是研究肺部抗感染模型的重要细胞类型。猪 鲜健康猪肺 ，用棉绳扎住气管，置于装有冰块的保温盒中1h 繁殖与呼吸综合征 (porcinereproductiveandrespiratorysyn— 内带回实验室。 drome，PRRS)，俗称猪蓝耳病，是由动脉炎病毒科中的猪繁殖 1．1．2 试验药品 DMEM及 RPMI一1640培养液(Gibco)， 与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以繁殖障碍和呼吸系统 二甲基亚砜 (DMSO，Sigma，G2650)，新生牛血清 (杭州四季 症状为特征的一种急性、高度传染的病毒性传染病 ，已成为威 青)，小鼠MAC387抗体 (abeam，ab22506)，山羊抗小 鼠IgG 胁全球养猪业发展的重要传染病之一…。猪肺泡巨噬细胞 (Biowodd)，Hoeehst33342DNA染料 (Sigma)，台盼蓝、PBS、多 (porcinealveolarmaerophages，PAM)与PRRSV有特殊的亲和 聚甲醛(PFA)等均为国产分析纯试剂。 力和嗜性，是 PRRSV首先攻击的靶细胞 ，感染后PAM被 1．2 方法 大量破坏，吞噬和免疫能力大大降低 ，从而使猪对继发感染易 1．2．1 PAM的分离培养 用肺泡灌洗法分离 PAM，用漏斗 感” 】。目前，猪PRRS防治的研究主要集 中在疫苗的研制 将约200mL无菌、4℃预冷的PBS(含 100tLs／mL青霉素和 方面，但免疫效果并不十分理想 ，PRRSV在体内的复制具有 100I~g／mL链霉素)从气管灌入肺脏内，轻轻按摩肺叶后倒出 抗体依赖增强效应(ADE)，且疫苗病毒存在与野毒重组成感 支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALF)，重复 染力更强的毒株的风险 。在体外，PRRSV只在含有巨噬细 上述冲洗过程3～4次，将每次得到