生化分离技术第三章萃取和浸取技术.pptVIP

第三节 新型萃取技术 　 由3-23可知，在较低的KCl浓度下，蛋白质几乎全部被萃取；当KCl浓度高于一定值时，萃取率就开始下降，直至几乎为零。当然，不同蛋白质开始下降时的KCl浓度是不同的。 　（3）表面活性剂的种类和浓度的影响 阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂都可用于形成反胶团，关键是应从反胶团萃取蛋白质的机理出发，选用有利于增强蛋白质表面电荷与反胶团内表面电荷间的静电作用和增加反胶团大小的表面活性剂。除此以外，还应考虑形成反胶团变大（由于蛋白质的进入）所需的能量的大小以及反胶团表面的电荷密度等因素，这些都会对萃取产生影响。 　增大表面活性剂的浓度可增加反胶团的数量，从而增大对蛋白质的溶解能力。但表面活性剂浓度过高时，有可能在溶液中形成比较复杂的聚集体，同时会增加对反萃过程的难度。 第三节 新型萃取技术 　（4）溶剂体系的影响 溶剂的性质，尤其是极性，对反胶团的形成，大小都有很大的影响。常用的溶剂有烷烃类（正乙烷、环乙烷、正辛烷、异辛烷、正十二烷等），四氯化碳，氯仿等。有时也添加助溶剂。如醇类（正丁醇等）来调节溶剂体系的极性，改变反胶团的大小，增加蛋白质的溶解度。 　（5）温度的影响 温度的变化对反胶团系统中的物理化学性质有激烈的影响，提高温度能够提高蛋白质在有机相的溶解度。例如增加温度可使α胰凝乳蛋白酶和胰增血糖素进入NH+—氯仿相，并在转移率上分别增加50%和100%。 第三节 新型萃取技术 　盐的种类和浓度对双水相萃取的影响主要反映在两个方面，一方面由于盐的正负离子在两相间的分配系数不同，两相间形成电势差，从而影响带电生物大分子在两相中的分配。例如在8%聚乙烯二醇—8%葡聚糖，0.5m·mol/L磷酸钠，pH=6.9的体系中，溶菌酶带正电荷分配在上相，卵蛋白带负电荷分配在下相。当加入浓度低于50mmol/L的NaCl时，上相电位低于下相电位，使溶菌酶的分配系数增大，卵蛋白的分配系数减小。 　另一方面，当盐的浓度很大时，由于强烈的盐析作用，蛋白质易分配于上相，分配系数几乎随盐浓度成指数增加，此时分配系数与蛋白质浓度有关。不同的蛋白质随盐的浓度增加分配系数增大程度各不相同，利用此性质可有效地萃取分离不同的蛋白质。 第三节 新型萃取技术 　pH值会影响蛋白质分子中可离解基团的离解度，调节pH值可改变蛋白质分子的表面电荷数，电荷数的改变，必然改变蛋白质在两相中的分配。另外pH值影响磷酸盐的解离，改变 和 之间的比例，从而影响聚乙二醇—磷酸钾系统的相间电位和蛋白质的分配系数。对某些蛋白质，pH值的微小变化，会使蛋白质的分配系数改变2～3个数量级。 　 温度影响双组分系统的相图，因而影响蛋白质的分配系数。特别是在临界点附近，系统温度较小的变化，可以强烈影响临界点附近相的组成。当双水相系统离临界点足够远时，温度的影响很小。由于双水相系统中，成相聚合物对生物活性物质有稳定作用，常温下蛋白质不会失活或变性，活性效率依然很高。因此大规模双水相萃取一般在室温下操作，节约了冷却费用，同时室温下溶液黏度较低，有利于相分离。 第三节 新型萃取技术 　 3．双水相系统的应用实例 　双水相萃取分离技术在生化工艺过程，中草药有效成分的提取，双水相萃取分析方面均得到成功应用，部分已实现工业化。 　（1）酶的提取和纯化 双水相的应用始于酶的提取。由于聚乙二醇—精葡聚糖体系太贵，而粗葡聚糖黏度又太大，目前研究和应用较多的是聚乙二醇—盐系统。如用PEG1000—磷酸盐组成的水相系统，萃取葡萄糖—6—磷酸脱氢酶，料液中湿细胞含量可高达30%，酶的提取率可达91%。在萃取酶的双水相系统中，酶主要分配在上相，菌体在下相或界面上。如果条件选择合适，不仅可以从发酵液中提取酶，实现它与菌体的分离，而且还可以把各种酶加以分离纯化。 第三节 新型萃取技术 　（2）?—干扰素的提取 由于双水相系统萃取操作条件温和，成相的聚合物对生物活性分子有保护作用，所以特别适用于?—干扰素这些不稳定的，在超滤时易失活的蛋白质的提取和纯化。?—干扰素是合成纤维细胞或小鼠体内细胞的分泌物，培养基中总蛋白为1g/L，而它的浓度仅为0.1mg/L,用一般的聚乙二醇—葡聚糖体系，不能将?—干扰素与主要蛋白分开，必须使用带电基团或亲和基团的聚乙二醇衍生物如PEG—磷酸酯与盐的系统，才能使?—干扰素分配在上相，杂蛋白完全分配在下相而得到分离，并且?—干扰素浓度越高，分配系数越大，纯化系数甚至可高达350。这一技术已用于1×109单位?—干扰素的回收，收率达97%，干扰素的活性≥1×106单位/mg蛋白质。这一方法与层析技术相结合，组成双水相萃取—层析联合流程已成功用于生产。 第三节 新型萃取技术 　（3）中