生化分离技术第四章沉淀技术.pptVIP

第二节 蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用 7．金属离子沉淀法 一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效。它们可以分为三类。第一类为Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+，和Cd2+能和羧酸、含氮化合物如胺以及杂环化合物相结合。第二类为Ca2+，Ba2+，Mg2+和Pb2+能和羧酸结合，但不和含氮化合物相结合。第三类为Ag+，Hg2+和Pb2+能和巯基相结合。金属离子沉淀法的优点是它们在稀溶液中对蛋白质有较强的沉淀能力。处理后残余的金属离子可用离子交换树脂或螯合剂除去。 在这些离子中，应用较广的是Zn2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+和Mn2+，而Fe2+、Pb2+、Hg2+等较少应用，因为它们会使产品损失和引起污染。Zn2+用于沉淀杆菌肽（作用于第4个组氨酸残基上）和胰岛素；Ca2+(CaCO3)用于分离乳酸，血清清蛋白和柠檬酸；硫酸钡在柠檬酸生产中用以去除重金属离子，而MgSO4用以去除DNA和其他核酸；核酸也可用链霉素硫酸盐除去，用量为（0.5～1.0）mg/mg蛋白质，用于从发酵液中去除DNA和RNA也很有效。 第二节 蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用 二、沉淀技术的应用 沉淀是一个广泛应用于生物产品（特别是蛋白质）下游加工过程的单元操作。沉淀技术分离蛋白质的主要特点是：浓缩速度快、产物稳定性得到提高、可以做为其它分离方法的前处理。下面介绍盐析法分离血清中各主要蛋白质组分的例子。 第二节 蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用 注： PBS＊＊ 为磷酸缓冲液，0.2M，pH7.2并加入氯化钠至0.15M。 沉淀技术 第一节 蛋白质沉淀的基本原理 第二节 蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用 第一节 蛋白质沉淀的基本原理 一、蛋白质的溶解性 蛋白质是由许多氨基酸缩水形成的一条或几条多肽链所组成的两性高分子聚合物，溶解性是由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基向内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体机构的外表面。因此，蛋白质表面大部分是亲水的，而其内部大部分是疏水的 (见图4-1) ，亲水和疏水区域的分布和程度将决定蛋白质在水相环境中的溶解程度。在生理pH值条件下，如果这些可离子化的基团和水分子在蛋白质表面同时存在，则离子化基团至少能部分带电并被溶剂化。分子量的大小对蛋白质的溶解度也会有影响，通常情况下分子量小的蛋白质比起在结构上类似的大分子量蛋白质更易溶解。 第一节 蛋白质沉淀的基本原理 另外，蛋白质的溶解度同样也取决于所处环境的物理化学性质。影响蛋白质溶解度的外部因素主要有温度、pH、介电常数和离子强度。但是在同一特定的外部条件下，不同的蛋白质具有不同的溶解度，这是因为溶解度归根结底取决于溶质本身的分子结构。如分子所带电荷的性质和数量、亲水与疏水基团的比例及两种基团在蛋白质分子表面的排列等。 第一节 蛋白质沉淀的基本原理 影响蛋白质溶解度的主要因素分成蛋白质性质和溶液性质两类。蛋白质性质的因素有：分子大小、氨基酸组成、氨基酸序列、可离子化的残基数、极性/非极性残基比率极性/非极性残基分布、氨基酸残基的化学性质、蛋白质结构、蛋白质电性、化学键性质；溶液性质的因素有：溶剂可利用度（如水）、pH值、离子强度、温度。由于改变蛋白质性质较难，故对其溶解度的调控，常常是通过改变溶液的性质来实现的。 当然，蛋白质也可用改变其结构的办法来使其不可溶，改变的方法是使埋藏在分子内部的疏水基团暴露出来，但这种分子结构的改变是不可逆转的，会引起蛋白质的变性。利用蛋白质的相对热稳定性，进行选择性变性，以用于蛋白质的分离，但这并不是真正的沉淀过程。 第一节 蛋白质沉淀的基本原理 二、蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质溶液是一种分散系统。蛋白质分子是分散相，水是分散介质。就其分散程度来说，蛋白质溶液属于胶体系统，但是它的分散相质点是分子，它是蛋白质分子与溶剂（水）所构成的均相系统，分散程度以分散相质点的半径来衡量。根据分散程度可以把分散系统分为3类：分散相质点小于1nm的为真溶液，大于100nm的为悬浊液，介于1nm～100nm的为胶体溶液。从蛋白质相对分子量的测定和形状的观测知道，其分子的大小已达到胶体质点1nm～100nm范围之内，具有胶体性质，如布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、粘度大以及不能透过半透膜的性质等。 第一节 蛋白质沉淀的基本原理 球状蛋白质的表面多亲水基团，具有强烈地吸引水分子作用，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围。实验证明，每一克蛋白质约可以结合0.3g～0.5g的水，使蛋白质分子表面形成一层水膜，称水化膜。蛋白质分子表面具有许多可解离的基团，