德国小蠊过敏原Blag8基因的克隆及原核表达毕业论文.doc

德国小蠊过敏原BLAG8基因的克隆及原核表达 -1- （《中国图书资料分类法》分类号）：R3 单位代码：10660 学 号：07001001030 贵阳医学院基础医学院 2012届基础医学（生物技术方向）专业本科学位论文 德国小蠊过敏原Bla g 8基因的克隆及原核表达 学 生： 杨 应 凤 年 级： 07 级 专 业： 基础医学（医学生物技术） 指导教师： 张春林教授、王赟讲师、龙高群 实习单位： 贵阳医学院生物学教研室 2012年 5 月 3 日 目 录 摘 要…………………………………………………………5 前言……………………………………………………………6 材料与方法…………………………………………………7 2.1材料……… …………………………………………………………7 2.1.1 物种来源………………………………………………………7 2.1.2 主要试剂…………………………………………………………7 2.1.3 主要仪器…………………………………………………………8 2.1.4 生物信息学分析软件…………………………………………9 2.2 方 法…………………………………………………………9 2.2.1部分序列的获取………………………………………………9 2.2.2 RACE获得全长序列……………………………………………9 5’RACE PCR引物的设计………………………………………9 RACE RNA的准备及逆转录获得第1链cDNA ………………10 5’RACE PCR扩增及检测 ………………………………10 5’RACE PCR产物的纯化 ……………………………12 大肠杆菌感受态细胞的制备 …………………………12 PMD18-T-Bla g 8 重组质粒的连接转化 …………………13 阳性克隆的筛选………………………………………………14 菌液PCR验证及取菌液PCR测序…………………………14 拼接获得全长序列及搜索其ORF…………………………14 2.2.3 全长克隆………………………………………………………14 全长引物的设计………………………………………………14 PCR扩增及纯化………………………………………………14 感受态细胞的制备……………………………………………15 连接及转化 …………………………………………………15 重组质粒的提取、转化表达菌BL21及阳性克隆的筛选…… 16 2.2.4 全长DNA序列的生物信息学分析及功能预测 ………………17 2.2.5重组蛋白的表达与纯化 ………………………………………17 IPTG诱导预表达 …………………………………………18 SDS检测 …………………………………………18 重组蛋白可溶性的分析 ……………………………………19 重组蛋白表达条件的优化 …………………………………19 重组蛋白的大量表达…………………………………………20 重组蛋白的纯化 ……………………………………………21 表达产物的检测 ……………………………………………22 结果分析 ……………………………………………………………22 3.1 PCR扩增反应……………………………………………………22 3.2重组质粒转化鉴定结果……………………………………………23 3.3 Bla g 8全长序列测序及生物信息学分析………………………24 3.3.1 Bla g 8全长序列测序结果……………………………………24 3.3.2 Bla g 8测序所得序列生物信息学分析 ………………………25 3.3.3 Bla g 8变应原性的分析…………………………………………29 3.4重组蛋白的预表达结果……………………………………………31 3.5重组蛋白可溶性的分析结果………………………………………32 3.6重组蛋白的表达优化结果 ………………………………………33 3.6.1重组蛋白的时间诱导表达优化结果……………………………33 3.6.2重组蛋白的IPTG浓度诱导表达优化结果………………………33 3.7重组蛋白的纯化……………………………………………………34 3．