实验植物组织中丙二醛含量的测定.pptVIP

实验12 植物组织中丙二醛含量的测定 一、实验目的 1.掌握植物体内丙二醛含量测定的原 理及方法。 2.了解丙二醛积累对细胞的伤害 二、实验原理 逆境或衰老 膜脂的过氧化作用 丙二醛 通过MDA了解膜脂过氧化作用及间接反应植物组织受伤害程度； MDA在酸性和高温条件下与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（ 3,5,5′-三甲基恶唑2,4-二酮），最大吸收波长532nm，最大干扰物质可溶性糖（吸收峰450nm），用双组分分光度法排除。 计算公式P173：44-2、44-3 硫代巴比妥酸 TBA 丙二醛 3,5,5′-三甲基恶唑2,4-二酮 （三甲川） 酸性 红棕色 三、实验器材 1、材料：受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官 2、仪器：紫外分光光度计、离心机 3、试剂： ＞10%三氯乙酸（TCA） ＞ 0.6%硫代巴比妥酸（先加少量1mol/L氢氧化钠溶解，再用10%三氯乙酸定容） ＞石英砂 四、实验步骤 1 MDA的提取：称1g叶片，加入2ml 10% TCA及少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml 10%TCA进一步研磨，定容至10ml,匀浆以4000r/min 离心10min，其上清液即为MDA提取液。 2 MDA的测定:取2ml MDA提取液（对照加2ml蒸馏水），加2ml 0.6％TBA,混和液在沸水浴中保温15min后，立即置于冰浴中冷却，然后离心10min，于波长532nm、450nm和600nm下测定OD值。 五、结果计算 以测得的OD532减去OD600的非特异吸收值，分别计算衰老和正常组的值。 MDA浓度(μmol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450 MDA含量(μmol/g FW)＝ D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的光密度值。 注意事项 MDA-TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10-15min之间。时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降； 如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。 可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。 4．注意事项： (1) 0.1~0.5％的三氯乙酸对MDA—TBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高； (2) MDA—TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10~15min之间。时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降； (3) 如用MDA作为植物衰老指标，首先应检验被测试材料提取液是否能与TBA反应形成532nm处的吸收峰。否则只测定532、600nm两处A值，计算结果与实际情况不符，测得的高A值是一个假象； (4) 在有糖类物质干扰条件下(如深度衰老时)，吸光度的增大，不再是由于脂质过氧化产物MDA含量的升高，而是水溶性碳水化合物的增加，由此改变了提取液成分，不能再用532nm、600nm两处A值计算MDA含量，可测定510、532、560nm处的A值，用A532一(A510—A560)/2的值来代表丙二醛与TBA反应液的吸光值。 六 、思考题 1.说明膜脂过氧化作用的对植物的影响。 2.正常植物与衰老时相比丙二醛含量有什么变化，分析其原因。 * 植物组织或器官在衰老或逆境下遭受伤害，往往发生膜脂的过氧化作用。膜脂过氧化的指标有很多，如丙二醛（MDA）的产生、过氧化物的碘量滴定、氧吸收、共轭双键测定等。由于MDA的测定方法简便，所以常用来评价植物脂过氧化强弱的指标。 测定组织或器官脂质的过氧化反应所产生的丙二醛含量时，通常利用硫代巴比妥酸（TBA）在酸性下加热与组织中的MDA产生显色反应，反应产物是粉红色的3,5,5-三甲基噁唑2,4-二酮。用分光光度计测定532nm及600nm波长时的光密度值，根据光密度的大小可计算MDA含量。 * 植物组织或器官在衰老或逆境下遭受伤害，往往发生膜脂的过氧化作用。膜脂过氧化的指标有很多，如丙二醛（MDA）的产生、过氧化物的碘量滴定、氧吸收、共轭双键测定等。由于MDA的测定方法简便，所以常用来评价植物脂过氧化强弱的指标。 测定组织或器官脂质的过氧化反应所产生的丙二醛含量时，通常利用硫代巴比妥酸（TBA）在酸性下加热与组织中的MDA产生显色反应，反应产物是粉红色的3,5,5-三甲基噁唑2,4-二酮。用分光光度计测定532nm及600nm波长时的光密度值，根据光密度的大小可计算MDA含量。