穿孔素和颗粒酶B检测对胰腺移植急性排斥反应早期诊断的研究.pdfVIP

穿孔素和颗粒酶B 检测对胰腺移植急性排斥反应早期 诊断的研究 韩方海，张肇达，胡伟明，柯能文，田伯乐，李全生 四川大学华西医院普通外科，成都（610041 ） E-mail ：Zhangzhaoda@ 摘 要：目的：研究胰腺移植术后外周血穿孔素和颗粒酶B 的 基因表达对急性排斥反应早 期诊断的价值。方法：实验动物为四川等地杂种长白猪，分为3 组（n=8 ）即对照组；移植 组；移植+免疫抑制剂治疗组。移植手术为同种异体门静脉回流、肠内引流全胰十二指肠移 植。免疫抑制剂治疗组在行同种异体胰十二指肠移植术同时应用环孢 A+骁悉+ 甲强龙三联 免疫抑制治疗。分别于术前 1 天和术后1、3、5、7 天采集受者锁骨下静脉血，抽提总RNA ， RT-PCR 方法检测静脉血淋巴细胞中穿孔素和颗粒酶B 的 mRNA 表达，检测受者血糖、胰 岛素、胰高血糖素水平。在术后1、3、5、7 天，开腹取胰腺组织进行常规病理学检查，与 血液中穿孔素和颗粒酶B 的mRNA 表达水平进行比较分析。结果：①对照组、胰腺移植组 及移植+免疫抑制剂组之间受体的血糖、胰岛素、胰高血糖素水平变化无显著性差异，P0.05 。 ②与胰腺移植组比较移植+免疫抑制剂组静脉血淋巴细胞中穿孔素和颗粒酶B 的 mRNA 表 达水平有显著性差异，P ＜0.05。③胰腺移植术后静脉血穿孔素、颗粒酶B mRNA 表达变化 比急性排斥反应病理学改变早2-4 天。结论：监测外周血淋巴细胞中穿孔素和颗粒酶B mRNA 表达的变化可以早期诊断胰腺移植急性排斥反应，结合常规病理学检查可以对胰腺急性排斥 反应做出早期诊断。 关键词：胰腺移植，排斥反应，早期诊断，穿孔素，颗粒酶B 胰腺移植和胰肾联合移植是治愈糖尿病以及糖尿病并发症的有效手段。在外科手术成功 率提高以后，胰腺移植以后急性排斥反应导致免疫性病理损害是使移植物丧失功能的一个主 [1] 要原因 。由于缺乏早期诊断胰腺移植排斥反应比较敏感、特异性指标，至出现临床症状或 移植物功能改变已不是排斥反应早期，只能控制不能逆转免疫性病理损害造成的组织损伤。 急性排斥反应主要是T 细胞介导的免疫应答，CD8+活性CTL 细胞分泌的穿孔素和颗粒酶杀 伤靶细胞以及颗粒酶和 Fas-Fasl 途径诱导靶细胞凋亡是造成移植器官免疫病理损害的主要 原因[3] 。CTL 细胞毒性效应分子穿孔素和颗粒酶 B 在发生急性排斥反应的早期即可在外周 血和移植胰腺局部表达,可以作为早期诊断急性排斥反应的敏感、无创、特异性指标。本研 究探讨穿孔素和颗粒酶B 在外周血的mRNA 表达对胰腺移植急性排斥反应诊断价值。 1. 材料与方法 1.1 实验动物 四川当地杂交长白猪，体重25-30kg ，猪龄4 个月，雌雄不限。 1.2 实验材料 葡萄糖（Glu ）测定—GOD—POD 法试剂盒：四川 MAKER 公司、血浆胰高血糖素 （Glucagon ）放射免疫分析试剂盒：北京北方生物技术研究所、免疫活性胰岛素放免试剂盒： 成都华西糖尿病科学技术开发研究所。TRIZOL RNA 提取试剂（SV Total RNA isolation system）：购自Promega 公司、焦碳酸二乙酯(DEPC) ：购自Sigma 公司、溴化乙淀(EB)：购 自Fluka 瑞士、TakaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)：购自Takara Shuzo 日本、MNA Marker DL2,000 ： 购自TaKaRa 公司 、琼脂糖：购自BOEHRINGER MANNHEAM 公司、全自动 PTC-100 PCR 仪：美国 Bio-Rad 公司、Quality one 凝胶成像分析系统：美国 Bio-Rad 公司。 -1- 测序反应试剂：BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing R