慢病毒导入CDC25B3 siRNA对胰腺癌细胞生物学行为的影响.pdfVIP

慢病毒导入的CDC25B3 siRNA对胰腺癌细胞生物学 行为的影响1 1※ 杨正平 ，石欣 ，肖志 ，张齐 ，孔波 1东南大学附属中大医院普外科，江苏南京（210009） E-mail: jorya127@126.com 摘要：目的：利用已构建成功的在人胰腺癌细胞系 CFPAC-1 中稳定抑制 CDC25B3 的重组 慢病毒，建立 CDC25B3 表达降低的细胞系，以便客观研究该基因的作用。方法：将产生 CDC25B3 siRNA 分子的携带绿色荧光蛋白（GFP ）的重组慢病毒感染细胞后用流式细胞仪 筛选稳定表达的细胞系。应用RT-PCR 和 Western blot 对细胞中 CDC25B3 的 mRNA 和蛋白 表达水平进行分析，MTT 法、流式细胞仪、平板克隆形成和 Transwell 小室法分别检测其对 细胞增殖、周期、细胞克隆形成能力和迁移能力的影响。结果：CDC25B3 siRNA 显著下调 了CFPAC-1 细胞中 CDC25B3 的表达，所构建的重组慢病毒导入的 siRNA 有较高的沉默效 率，CFPAC-1 细胞的增殖能力、克隆形成能力以及迁移能力显著增强，细胞周期无明显改 变。结论：研究证实了 CDC25B3 基因可显著地影响胰腺癌 CFPAC-1 细胞的增殖、克隆形 成和迁移能力，为利用 CDC25B3 所介导的信号通路进行肿瘤基因治疗提供了实验依据。 关键词：胰腺癌 CDC25B3 慢病毒 siRNA 生物学行为 中图分类号:R735.9 Q503 1. 引言 [1] 近年来研究发现CDC25B是一种潜在的癌基因 ，在许多肿瘤的发生发展中起到重要作 用。CDC25B包括三个剪切异构体，即CDC25B1、CDC25B2 和CDC25B3 。我们已有的研究 结果表明，CDC25B在胰腺癌组织中的表达是正常组织中的 3.13 倍；此外，我们还发现在四 种胰腺癌细胞CFPAC-1、BxPC-3 、SW-1990 和Panc-1 中，CFPAC-1 中CDC25B的表达较另三 种细胞为高；其中CDC25B1 和B2 在四种细胞中均为过表达，而B3 的表达则较B1 和B2 低 （另文发表）。但CDC25B 的三种剪切异构体在胰腺癌的发生发展中各自起着怎样的作用， 目前还不明了。本研究中，我们利用CDC25B表达较高的CFPAC-1 细胞作为研究对象，利用 通过三质粒载体系统，即pGCL-GFP （绿色荧光蛋白）载体、pHelper 1.0 (gag/pol元件)载体、 Helper 2.0 (VSVG元件)载体构建成功的靶向CDC25B3 的siRNA稳定真核表达的慢病毒（另 文发表），建立了CDC25B3 表达降低的CFPAC-1 稳定细胞系，以研究CDC25B3 对人胰腺癌 细胞生物学行为的影响，探讨CDC25B3 在胰腺癌发病机制中的作用。 2. 材料与方法 2.1 试剂 胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（Sigma 公司），DMEM 培养液，T4 DNA 连接 酶，RNA 提取 Trizol 试剂盒（Invitrogen 公司），RT-PCR 试剂盒（大连宝生物公司），细胞 周期检测试剂盒（Keygen 公司），Matrigel 胶（美国 BD 公司），LV-shCDC25B3 慢病毒重组 1本课题得到国家自然科学基金（项目编号）的资助。 ※通讯作者：石欣，医学博士，主要从事胰腺疾病的基础和临床研究。 - 1 - 载体，LV-negative-shCDC25B3 对照慢病毒重组载体。 2.2 细胞株 人胰腺癌细胞株 CFPAC-1 由东南大学临床医学院中心实验室保存。 2.3 CFPAC-1 细胞及阳性细胞克隆的分选及鉴定 细胞培养于 50ml细胞培养