AdTERT-TRAIL对腺样囊性癌SACC-83靶向转基因作用的研究.pdfVIP

AdTERT-TRAIL对腺样囊性癌SACC-83 靶向转基因 作用的研究1 苏涛，孙宏晨，臧光祥，苗雷英 吉林大学口腔医学院 口腔生物医学工程吉林省重点实验室（130041） E-mail：hcsun@ 摘 要： 目的：观察腺病毒载体 AdCMV-TRAIL 和 pACTERT-TRAIL 对腺样囊性癌细胞 SACC-83 增殖 能力与凋亡的影响。方法：采用磷酸钙沉淀法将 pACCMV-TRAIL 和 pACTERT-TRAIL 与 pJM 17 共转染 293 细胞，得到重组腺病毒 AdCMV-TRAIL 和 AdTERT-TRAIL。以AdCMV-EGFP 、AdTERT-EGFP 、AdCMV-TRAIL 和 AdTERT-TRAIL 转 染 SACC-83 细胞和和人胚肺HEL ，经 RT-PCR 、MTT 技术和流式细胞仪检测转染细胞 TRAIL 基因的 mRNA 表达、增殖能力以及凋亡水平。结果：CMV 启动子在 SACC-83 和 HEL 细胞 均可以启动TRAIL 基因，从而导致这两种细胞凋亡；hTERT 启动子在端粒酶阳性的 SACC-83 细胞能使 TRAIL 基因高表达，而在 HEL 细胞中呈低表达。结论：成功构建了 AdCMV-TRAIL 和 AdTERT-TRAIL 两种腺病毒载体； hTERT 介导的腺病毒载体可以诱导 TRAIL 基因在 SACC-83 中高效、特异性表达，并引起此细胞大量凋亡。 关键词：hTERT TRAIL 基因 腺病毒载体 转基因 腺样囊性癌 1．引言 在肿瘤基因治疗中，目的基因的能否特异表达及表达量的多少是决定基因治疗效果的重 要因素之一，我们的研究已初步证实腺样囊性癌细胞中表达端粒酶[1]，而正常涎腺上皮细 胞不表达，因此以端粒酶为靶点、治疗腺样囊性癌具有较好的靶向性，但是质粒载体的转染 效率比较低[2]，仅为 30％－40％，诱导凋亡细胞的百分比不高。有证据表明[3]，hTERT 在静止期或 G0 期干细胞中可能不发挥作用，并且干细胞通常处于静止期。骨髓细胞中原始 干细胞及其分化成熟的细胞具有较低的端粒酶活性，而其前体细胞则有较高的端粒酶活性， 提示 hTERT 启动子如果对干细胞有毒性作用也是短暂的，而且干细胞对腺病毒的感染具有耐 受性，即使使用高浓度的腺病毒载体，并延长细胞－载体的作用时间，也只有少量的干细胞 被感染。因此，如果把 hTERT 启动子和转染干细胞效率低的腺病毒载体一起使用的话，由 hTERT 启动子介导的促凋亡基因在干细胞中表达产生的毒性将是很小的。为此，我们构建了 含有 hTERT 启动子的腺病毒载体，以此介导TRAIL 基因的表达，旨在提高载体的对细胞的转 染效率和诱导凋亡的能力。 2．材料与方法 2．1 主要试剂 293 细胞（Clontech 公司），含 TRAIL 基因的穿梭质粒 pACCMV-TRAIL 和 pACTERT-TRAIL、 腺病毒质粒 pJM17、AdCMV-EGFP 和 AdTERT-EGFP（美国 NIH 郑长玉博士馈赠）。 2．2 实验方法 1 本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20030183068 ）资助 - 1 - 2．2．1 重组腺病毒载体的构建 分别将pACCMV-TRAIL和pACTERT-TRAIL与pJM17采用磷酸钙沉淀法共转染293细胞，约7 －10d左右，可以看到边界清楚的噬斑，挑取噬斑，得到重组腺病毒AdCMV-TRAIL和 AdTERT-TRAIL。-70℃/+37℃反复冻融3次以裂解细胞，离心后收集含病毒的上清，部分上清 用于鉴定重组腺病毒基因组DNA，其余上清重新感染293细胞大量扩增病毒，重复扩增3次， 用氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒载体，再经Pierce Slide-A-L