二硫键稳定抗CD3_抗Pgp微型双功能抗体构建_表达及活性测定.pdfVIP

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2009, July 25; 25(7): 1042-1048 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ © 2009 Institute of Microbiology, CAS CSM, All rights reserved 医学与免疫生物技术 CD3/Pgp , , , , , , , , , , 苏晔 刘娟妮 高瀛岱 秦立 杨铭 王金宏 许元富 邵晓枫 纪庆 熊冬生 杨纯正 , 300020 : 向抗CD3/抗Pgp(P-glycoprotein)微型双功能抗体(Diabody) 中引入二硫键, 使 diabody 两条链以共价键交联, 增 强其稳定性。用重叠PCR(Overlap PCR)和PCR 方法, 将抗CD3/抗Pgp diabody 中抗CD3 或抗Pgp 轻重链可变区的适当 部位定点突变成半胱氨酸, 进行原核表达。表达产物经阳离子层析柱和抗 Etag 亲和层析柱分离纯化, 还原性和非还原 性 SDS电泳鉴定。应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(FCM)检测生物学活性。将改造 前后的两种抗体分别置37oC 含0.2%人血清白蛋白(Human serum albumin, HAS)的PBS 中孵育, 取多个时间点比较两者 与两种把抗原的结合能力。基因重组质粒经测序证实序列正确。向抗Pgp 轻重链引入突变的diabody(dsPgp-diabody)在 原核表达系统中, SDS显示纯化后的蛋白二硫键不能配对。而向抗CD3 轻重链引入突变的diabody(dsCD3-diabody) 能够在原核表达系统中进行可溶性表达, 二硫键能够正确配对。并且与改造前的diabody 相比, dsCD3-diabody 的抗原结 合特异性没有改变, 抗原结合和竞争活性均无下降。改造前的diabody 在37oC PBS(0.2% HAS) 中孵育1 h 后活性即开始 下降, 24 h 后活性完全丧失; 而dsCD3-diabody 孵育72 h 后活性并无明显下降。本实验成功构建了dsCD3-diabody, 并且 能够进行可溶性表达。向 diabody 抗 CD3 轻重链区引入的二硫键在宿主菌中可以正确配对, 抗原结合活性没有明显下 降, 而稳定性大大增强。向diabody 轻重链区引入二硫键, 以增强其稳定性的方法是可行的。 : 基因工程抗体, diabody, 二硫键, 药物稳定性 Construction and expression of disulphide stabilized anti-CD3/anti-Pgp diabody Ye Su, Juanni Liu, Yingdai Gao, Li Qin, Ming Yang, Jinhong Wang, Yuanfu Xu, Xiaofeng Shao, Qing Ji, Dongsheng Xiong, and Chunzheng Yang State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology Hospital of Blood Diseases , Chinese Academic of Medical Sciences Peking Union