基于固相载体可逆化固定法(SPRI)___提取质粒DNA机理研究.pdfVIP

摘要 本文就质粒 DNA 在羧基纳米磁性粒子表面的可逆化吸附行为做了相应的 试验研究和理论探讨。分别考察了不同PEG 浓度梯度对SPRI 法和PEG 静置沉 降法提取质粒DNA 的影响。通过比较发现，质粒DNA 在纳米磁性粒子表面的吸 附受PEG 浓度的影响很大；当PEG 浓度高于9%时，质粒DNA 在粒子表面大量 吸附，而对于PEG 静置沉降法，此临界浓度为11%，说明质粒DNA 在羧基粒子 表面的可逆化吸附行为与DNA 脱水有关,并受表面羧基的影响。羧基与带负电 + 荷的DNA 之间可能通过Na 形成静电桥而相互吸引，使得质粒DNA 在羧基纳米 磁性粒子表面大量吸附。 关键词： SPRI, PEG, 质粒DNA, 固相载体, 静置沉降法 1 目录 摘要 1 关键词 1 前言 4 1.材料与方法 5 1.1 试剂与仪器 5 1.2 菌种活化 6 1.3 细菌增殖 6 1.4 菌体裂解 6 1.5 静置沉降法最适条件的优化 6 1.5.1 静置时间质粒DNA 产量的影响 6 1.6 PEG 浓度对静置沉降法提取质粒DNA 回收的影响 7 1.7 PEG 浓度对SPRI 法提取质粒DNA 回收的影响 7 1.8 不添加磁性粒子时PEG 浓度对SPRI 法提取质粒DNA 回收 的影响 8 1.9 琼脂糖凝胶电泳和吸光度测定 8 2 ．结果与分析 8 2 2.1 静置时间对沉降法提取质粒DNA 产量的影响 8 2.2 离心时间对静置沉降法提取质粒DNA 产量的影响 9 2 ．3 PEG 浓度对静置沉降法提取质粒DNA 回收的影响 10 2 ．4 PEG 浓度对SPRI 法提取质粒DNA 的影响 11 2.5 不添加磁性粒子时PEG 浓度对SPRI 法提取质粒DNA 回收 的影响 12 3 ．讨论 12 3 ．1 静置沉降法中孵育时间和离心时间的确定 12 3 ．2 PEG 浓度对静置沉降法提取质粒DNA 回收的影响及机理13 3 ．3 PEG 浓度对SPRI 法提取质粒DNA 的影响及机理 14 参考文献 17 致谢 19 3 前言 细胞及各种生命大分子如核酸、蛋白质和多肽等的分离纯化是生命科学各 研究领域必不可少的环节。分离纯化技术的高低对整个生物科学的发展有着举 足轻重的作用。细胞裂解后经离心所得到的质粒DNA 粗提液，一般来说，不能 直接供分析使用，而需要经过一定的纯化步骤，以得到相对较纯的质粒DNA。 传统的 DNA 纯化方法多基于层析和离心沉降，特别是当今众多的商业化 DNA 提取试剂盒，将该特点发挥到了极至。但传统的方法需要层析柱、有毒试剂（如 苯酚）和昂贵的离心机，费力、费时，投入大而且不利于简化操作。利用磁性 载体分离纯化质粒DNA 近几年来得到各国科研人员的重视。与传统方法相比， 磁性载体法具有很大优势：首先，对离心机依赖程度大大降低，甚至可以免去 离心；其次，操作简单，有时可集所有操作于一只离心管中完成，中间只涉及 到几种试剂的添加；第三，可实现微量分析要求，且得到的质粒DNA 可不经洗 [1] 脱而直接用于PCR 。此外，磁分离法操作缓和，有利于保证DNA 完整性。 由于磁性载体的表面性质不同，其分离纯化原理也不一样。其中基于固相 [2] 载体可逆化固定 （solid phase reversible immobilization，SPRI）的分 离纯化方法得到了广泛的研究和应用[3]-[5] （如dynal 和agencourt 公司的DNA 磁性粒子，HGP 测序任务的三分之一都是借助 agencourt 的产品完成的）。在 一定浓度的PEG 和盐离子环境中，