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PF4及相关肽基因重组腺病毒的构建1 吴立华，刁世勇，蔡英林，李妍涵，顾洁，任倩，李彬，杨仁池，韩忠朝* 中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所，天津 （300020） E-mail ：tihzchan@ 摘 要：目的 利用细菌内同源重组法构建含PF4 （血小板第四因子）全长1-70及PF4的小肽 17-70基因重组腺病毒。方法 用PCR方法从我室构建含PF4全长及PF4的小肽17-70基因的原核 表达载体中调出两个基因片段而后再用PCR方法与MCP-1信号肽连接并扩增，用酶切基因片 段亚克隆至同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV 中，形成转移质粒 pAdtrack-CMV(PF4-1-70)和 pAdtrack-CMV(PF4-17-70) ，将之用PmeI酶切线性化后与腺病毒基 因重组质粒pAdEasy-1 共转化大肠杆菌BJ5183 ，抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒，PacI 酶切后用磷酸钙共沉淀方法转染293细胞，包装成重组体腺病毒Ad(PF4-1-70)和 Ad(PF4-17-70) 。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定，反复用293细胞扩增并用氯化铯密度 梯度纯化病毒,用TCID50方法测病毒滴度，利用同时购买的带有LacZ报告基因的对照重组腺病 毒（Ad- LacZ ）对感染效率进行监测。结果 利用电穿孔法分别将质粒pAdtrack-CMV(PF4-1-70), pAdtrack-CMV(PF4 - 17-70)与质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183获得70%以上的阳性重组 体细菌克隆。PCR检测结果表明重组腺病毒已含有目的基因，滴度为1010TCID50/ml。结论 细 菌内同源重组法构建腺病毒相比于传统的细胞内同源重组法，具有成功率高、方法简便、快 捷、实验周期短的优点，值得进一步推广使用。 关键词：腺病毒；PF4；相关多肽；同源重组；细菌 肿瘤的侵袭与转移，始终是制约临床疗效的最主要的问题。通过对血管新生的广泛研究， 其在肿瘤中的作用已得到了确认，可以通过阻断血管新生抑制肿瘤生长与转移，这样为肿瘤 治疗提供了一个新的有效的方案。抑制血管新生因子主要包括血管抑制素（angiostatin ）、内 [1，2] 。我們以 皮抑制素（endostatin ）、血小板第 4 因子（PF4 ）、凝血酶敏感蛋白（TSP ）等 往工作证明 PF4 能与血管刺激因子 b-FGF 直接结合形成复合物，从而抑制 b-FGF 聚合以及与 其受体结合，进而阻止 b-FGF 诱导的内皮细胞增殖抑制血管新生[3] 。PF4 抑制血管新生功能 主要在 C 末端与肝素结合的结构域。有文献证明 PF4 某些相关小肽在体外和体内与 PF4 具有 类似的生物学活性[4,5] 。与直接给予重组的抑制血管生成因子相比，基因治疗的优势在于可以 在局部维持较高水平的因子表达。由于腺病毒载体具有转移效率高、感染细胞谱广、病毒滴 度高和安全性好的优点，而成为肿瘤生物治疗临床试验的常用载体。本研究利用一种新型、 高效的细菌内同源重组腺病毒制备方法，构建了表达人 PF4 全长 1-70 及 PF4 的小肽 17-70 基 因的重组腺病毒，现将有关结果报告如下: 1 材料与方法 1.1 质粒、菌株和细胞 质粒 pAdEasy-1 ；pAdtrack-CMV ，菌株BJ5183; DH5α, HEK293细胞及 Ad5.CMV-LacZ.∆E1/∆E3 病毒颗粒均购于Qbiogene.公司。（质粒结构可查网址 ）。PF4全长及改构后的小肽17-70cDNA为我室保存。 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金的资助。 - 1 - 1.2 酶及其它生化试剂 限制性内切酶、T4 连接酶、PFu DNA 聚合酶等分别购自基因公司和华美公司，胎牛血 清，高糖DMEM培养基为Gbico公司产品，低熔点琼脂糖及氯化铯为Sigma公司产品，PCR 引 物由上海生工公司合成。 1.3 PF4-1