外周血单个核细胞中肺炎衣原体的分离、培养及传代.pdfVIP

外周血单个核细胞中肺炎衣原体的分离、培养及传代1 金前，孙书明，王卫群，余竹元 复旦大学附属金山医院呼吸科，上海（200540 ） E-mail ：sunsm2002@ 摘 要：目的 分离并培养肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae, Cpn ），并进行传代、扩增。 方法 分离血液标本中的外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC ）， 用PEG 使Cpn-Ag 阳性的PBMC 裂解释放出Cpn ，然后与Hep-2 细胞一起离心，继续培养 Hep-2 细胞。再将Hep-2 细胞冻融破碎后，放入到新的Hep-2 细胞中进行离心，以完成Cpn 的一次传代，然后以同样的方法进行二次传代。分别用微量免疫荧光法 （Micro-immunofluorescence, MIF ）及PCR 法检测Hep-2 细胞中的Cpn-Ag 和Cpn DNA。结 果 MIF 法检测Cpn 感染后的Hep-2 细胞，其胞内Cpn-Ag 阳性；MIF 法检测一次传代及二 次传代的Hep-2 细胞，其胞内Cpn-Ag 亦均阳性；PCR 法检测Cpn DNA 阳性。结论 该简 化方法可以实现PBMC 中Cpn 的分离，并实现进一步的培养及传代。 关键词：肺炎衣原体；外周血单个核细胞；培养；传代 肺炎衣原体是衣原体(Chlamydia pneumoniae, Cpn)属中的一个新种，是一类能通过细菌 滤器、严格细胞内寄生、并有独特发育周期的原核细胞型微生物。既往对于Cpn 致病的认 识往往局限在其导致社区获得性肺炎上，目前又有很多研究表明Cpn 与动脉粥样硬化密切 相关，Cpn 与肺癌[1]、中耳炎、结节病、咽炎、鼻窦炎、哮喘、Reiter 综合征等疾病的关系 亦在探索当中。因此Cpn 菌株成为这些科研能够开展的必要条件。但申请进口Cpn 菌株手 续繁琐，价格昂贵，进口菌株传代2 －3 次即退化，须不断引进。所以，在国内开发一种培 养、扩增Cpn 的简便方法迫在眉睫。本实验针对这一现状，试图开发一种低成本、易操作 的Cpn 培养、扩增方法。 1. 材料与方法 1.1 材料 外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell ，PBMC ）来自检测Cpn 抗原抗 体的临床血液标本；Hep-2 细胞株购自上海中科院细胞所；Hep-2 细胞消化液为0.25%的胰 蛋白酶；聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR ）试剂盒购自上海华美生物工程公司； AR-39 株肺炎衣原体抗原、微量免疫荧光法（Micro-immunofluorescence, MIF ）所需的肺炎 衣原体荧光素标记单克隆抗体（TT-401 ）均购自美国华盛顿大学衣原体研究基金会；聚乙二 醇（Polyethylene glycol, PEG ，分子量3000 ）为日本进口产品；淋巴细胞分离液、细胞培养 液及细胞培养瓶购自上海华美生物工程公司。 1.2 方法 1. 分离血液标本中的PBMC ：收集若干份采集时间各异的临床血液标本（每份3ml ）， 于4 ℃冰箱保存。静置后吸出血浆，剩余血细胞用等量的磷酸盐缓冲液（PBS ）稀释混匀, 再沿离心管壁缓慢加入到含有3ml 淋巴细胞分离液的离心管中。然后于室温950×g 离心 60min，用吸管小心吸出含PBMC 的云雾状层，用低渗溶液（由PBS 和蒸馏水以1：40 的 比例配制而成）洗涤PBMC 3 次。 2. PBMC 存活率计算：在每份分离好的PBMC 中取一部分，分别制成200-2000 个/ml 1本课题得到上海市科委基金资助项目（034119811 ）的资助。 -1- 浓度的悬液，用台盼兰拒染法测定每份PBMC 的存活率。 6 3. PBMC 裂解率计算：在每份分离好的PBMC 中取一部分，制成约10 个/ml 的细胞悬 液，取20µl 滴加在载玻片上，在显微镜下计算4 个视野完整细胞记数的平均值（A ），加入