阿维菌素4--OH氧化酶CYP107Z13的基因克隆、表达及功能验证.pdfVIP

摘要 阿维菌素是一种结构新颖、农畜两用的重要生物源杀虫剂，对阿维菌素4-OH进行改造可以 获得药效更高、杀虫谱更广的甲胺基阿维菌素苯甲酸盐(甲维盐)。当前，甲维盐的生产是以天然发 酵产物阿维菌素为前体，通过化学方法合成，其中最关键的反应步骤是将阿维菌素4”一OH氧化为-0。 由于在对阿维菌素4-OH氧化前后必须对分子中更加活跃的5．OH进行保护和去保护，且这个保护- 去保护过程操作复杂、条件要求苛刻，导致了甲维盐合成成本较高且对环境污染严重。寻求廉价、高 效、环保的生物催化剂，实现对阿维菌素4-OH的位点特异性氧化，将大大简化甲维盐的合成步 骤，有利于甲维盐的推广应用。据报道，一些链霉菌具有位点特异性氧化阿维菌素生成4”-O．阿 维菌素的功能。笔者针对链霉菌进行筛选，获得一株能够高效氧化阿维菌素4-OH生成-0的 ZB01，CGMCC h内 不吸水链霉菌菌株ZB01(Streptomycesahygroscopicus NO．2804)，该菌株在72 对初始浓度为lg／L的阿维菌素转化率达36％，是已报道的转化效率最高菌株的两倍多，具有较 ZB01为出发菌株，展开了一系列的研究。结果如 大的开发应用潜力。本研究以S．ahygroscopicus 下： ZB01菌株基因组中克隆到一条 1．利用同源克隆及染色体步移的方法，从ahygroscopicus bp，共编码429个氨基酸残基，经国际P450命名 cypl07z亚家族基因的同源基因，其全长1290 委员会命名为cypl07213，是cypl07z基因亚家族的第13个新成员。 lividians (Streptomyces TK54的电子传递系统实现电子传 TK54中成功表达，并且表达的CYPl07213能利用执,idans 递，完成位点特异性氧化阿维菌素4”-OH生成4”43．阿维菌素的反应。 3．对上述＆lividiansTK54重组菌的转化条件进行优化，结果显示，培养基种类、pn值和菌 6．0、改良ISP一2液体培 体的活力状态对重组茵转化阿维菌素的效率有不同程度的影响。其中pn 养基以及活化细胞有利于提高重组菌转化阿维菌素的效率。 coli coli BL21(DE3)中成功 BL21(DE3)中，经ELISA及CO差光谱法检澳4，证实CYPl07213已在E 表达，并采用Ni．柱亲和层析法纯化了带His6标签的活性CYPl07213重组蛋白。 5．利用纯化的CYPl07213重组蛋白，与铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶构建体外重组酶催 化体系，通过测定体系中NADPH的消耗，获得了该重组蛋白以阿维菌素为底物时的酶学参数， 其％值为1．4 s．。。 lxM，碥懈为0．041lxmol／min·nag，‰为0．033 关键词：阿维菌素，氧化酶，CYPl07213，功能，酶动力学 Abstract avermectin molt Averwlcctinisan bioinsecticide．Emamectinbenzoate，all derivative，is important than is