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实验一 培养基的配制与灭菌 一 教学要求 通过配制牛肉膏蛋白胨等培养基，掌握配制培养基的一般方法和步骤。 了解采用的灭菌方法和原理，掌握高压蒸汽灭菌技术。 二 实验原理 1、Media Types Solid Media,semi-solid Media, liquid Media . Enriched Media, Selective Media, Differential Media， combination selective and differential media 2 Sterilization – destruction of all forms of microbial life, including endospores.  Physical Methods —Moist heat Autoclaving ??? Action - protein denaturation. ??? Very effective method of sterilization; at about 15 psi（Ib/in2 ） of pressure (121oC [ 250oF]), all vegetative cells and their endospores are killed in about 15 min. ? —Dry heat Direct flaming ??? example: Inoculation loop Hot-air sterilization ??? Baking in oven ??? Very effective method of sterilization, but requires temperature of 170oC [ 340 oF]for about 2 hr. —Filtration –? Separation of bacteria from suspending liquid. –? Removes microbes by passage of a liquid or gas through a screen like material. Most filters consist of diatomaceous earth, cellulose acetate or nitrocellulose. –? 0.45 ?m filters removes most bacteria, 0.20 ?m more inclusive, viruses need 0.01 ?m. –? Useful for sterilizing liquids (enzymes, vaccines) that are destroyed by heat. 三 实验材料与器材 培养基：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1 mol/L NaOH、 1 mol/L HCl、KNO3 、K2HPO4·3H2O MgSO4·7H2O FeSO4·7H2O. 器材：玻璃器皿、天平、pH试纸、灭菌锅等 四 操作步骤 称量→溶解→调pH *→（过滤*）→分装*→ 加塞*→包扎→高压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌灭菌操作步骤 首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。 五 注意事项 培养基分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。 使用灭菌锅应严格按照操作程序进行。灭菌所需时间到后，要先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，才能打开排气阀。 六 思考题 在配制培养基的操作过程要注意哪些问题？ 高压蒸汽灭菌时，为什么要先将灭菌锅锅内的冷空气完全排尽？ * * 放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。 加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。 开启电源加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用 1.05 kg/ cm2 ，121.3 ℃，20 min灭菌。 灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污