用比较蛋白质组学技术筛选口腔黏膜上皮细胞体外癌变相关蛋白.docVIP

口腔上皮细胞论文：用比较蛋白质组学技术筛选口腔黏膜上皮细胞体外癌变的相关蛋白 [摘要]目的：探讨口腔黏膜上皮细胞在体外癌变不同阶段表达的差异蛋白质。方法：以口腔黏膜上皮细胞体外癌变模型为对象，采用双向凝胶电泳技术和图像分析软件PDQuest分离和分析不同阶段细胞间的差异蛋白质点，采用LC-MS/MS质谱分析系统鉴定差异蛋白质点，采用Gene Ontology Annotation将已知差异蛋白质进行分类。结果：采用双向凝胶电泳技术和图像分析软件PDQuest，得到差异蛋白质点54个，采用LC-MS/MS质谱鉴定后，共得到候选差异蛋白质45个。根据Gene Ontology Annotation分类，按细胞组成分布最多的差异蛋白质位于细胞质和细胞膜，按分子功能分布最多的是磷酸酶活性、催化活性、结构分子功能和钙离子结合功能，按生物过程分布最多的是代谢过程、细胞信号传导和细胞黏附与运动。结论：比较蛋白质组学方法中的双向凝胶电泳和质谱技术，能够很好分离和鉴定口腔黏膜上皮细胞体外癌变模型中不同阶段细胞的差异蛋白质。 [关键词]口腔鳞癌；体外癌变细胞模型；比较蛋白质组学 口腔鳞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，预后较差，5年生存率约为50%-60%[1-2]。随着生物标志物研究的深入，寻找具有临床诊断价值或预后判断价值的生物标志物，一直是研究的热点之一。而探索生物标志物在口腔鳞癌发生发展中的作用，也可为研究口腔鳞癌发病机制和治疗靶标提供依据。蛋白质组学可以从整体角度研究细胞内动态变化的蛋白质成分、表达水平与修饰状态。目前最常用的蛋白质组学方法是比较蛋白质组学技术，主要是双向凝胶电泳和质谱2个核心技术的联合应用。本课题的前期研究成功建立了口腔黏膜上皮细胞体外癌变模型[3-4]，在此基础上，我们采用比较蛋白组学研究方法分析口腔黏膜上皮细胞在癌变不同阶段的差异蛋白质，为进一步的蛋白质功能研究奠定基础。 1材料与方法 1.1细胞培养采用本课题组前期建立的口腔黏膜上皮细胞体外癌变模型的3种主要细胞，即永生化口腔黏膜上皮细胞(HIOEC细胞)、苯并芘诱导HIOEC细胞产生的癌变早期阶段细胞(HB56细胞)和诱导产生的典型鳞状细胞癌细胞(HB96细胞)。HIOEC细胞采用Defined keratinocyte-SFM培养液(Gibco，美国)，HB56和HB96细胞采用含10%胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)、1%谷酰胺和1%链霉素的DMEM培养液(Gibco，美国)，37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养[4]。 1.2细胞蛋白质提取 1.2.1裂解缓冲液8mol/L尿素65mmol/L DTT、4%(w/v)CHAPS、40mmol/L Tris、100(g/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)。 1.2.2蛋白质提取贴壁细胞用生理盐水洗涤3次，每培养皿细胞加入300μL裂解液，冰上超声破碎细胞，离心12,000×g，90min。使用Bradford法(Bio-Rad protein Dye assay reagent，美国)进行蛋白定量。 1.3双向凝胶电泳(two-dimensional gel elec-trophoresis，2-DE) 1.3.1第1向等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)采用固相pH梯度(immobilized pH gradients，IPG)预制非线性胶条(17cm，pH 3-10)(Amersham，美国)，400(g总蛋白质溶于水化上样缓冲液(含7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS、65 mmol/L DTT和0.001%溴酚蓝)，水化12h(17℃)，设置等电聚焦程序(17℃，每根胶条的极限电流50～70(A)：250V线性除盐30min，1000V快速除盐1h，10000V线性升压5h，10000V线性聚焦6 h，500V保持(17℃)。 1.3.2第2向SDS电泳胶条溶解后，采用平衡缓冲液(含6mol/L尿素、30%甘油、2%SDS、375mmol/L Tris-HCl pH 8.8)平衡2次，各15min。其中，前次缓冲液加2%DTT，后次缓冲液加2.5%碘乙酰胺；平衡后，转移到12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，起始时用的低电流(5mA)，待样品在完全走出IPG胶条、浓缩成一条线后，再加大电流(30mA)，直至溴酚蓝到达胶底。 1.4银染与图像分析 电泳胶采用固定液固定15min，增敏液增敏30min，MilliQ水漂洗3次，每次5min；银染20min；MilliQ水漂洗2次，每次1min；显色4min；加入终止液4min，终止反应10min。扫描银染凝胶(Bio-RadGS710 scanner，Bio-Rad，美国)，采用PDQuest软件分析图像，蛋白