禽网状内皮组织增生病病毒套式PCR检测方法的建立.pdfVIP

2012年第六届南京农业大学畜牧兽医学术年会论文集 禽网状内皮组织增生病病毒套式PCR 检测方法的建立 毕研丽1，孙翠平1，王金良1’2，郭广君卜2， 吕素芳1，苗立中1’2，沈志强k2 (1．山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600； 2．山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600) 摘要：根据GenBank中登录的禽网状内皮组织增生病病毒(REV)基因组序列，设计合成了2对引物，外部引物的扩增片段大小为467 bp，内 部引物的扩增片段大小为314 bp，建立了适合REV快速检测的套式PCR方法。采用该方法对REV毒株进行了检测，结果显示能扩增到314bp的 条带；禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结 果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 Pg，第2次扩增的敏感性是Ifs，第2次比第1次扩增的敏感性高105倍。所建立的套式PCR方法 具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点，可用于禽网状内皮组织增生病的临床诊断和分子流行病学调查。 关键词：禽网状内皮组织增生病病毒；套式PCR；检测 禽网状内皮组织增生病是由禽网状内皮组织增生 的早期诊断和流行病学调查提供一种有效的检测 病病毒(reticuloendothellosisvirus，REV)引起的以方法。 网状细胞增生为主要特征的一组综合征，被列为鸡群 7 1材料与方法 S disease 中除马立克氏病病毒(Marek virus，MDV) leukosis 和禽白血病病毒(avian virus，ALV)以外的1．1参考毒株 第三类致肿瘤病毒。REV隶属于反转录病毒科丙型 禽网状内皮组织增生病病毒(REV)、H9亚型 反转录病毒属，目前已分离到30多株REV，虽然不禽流感病毒(AIVH9)、新城疫病毒(NDV)、传染 同毒株的致病力不同，但都具有相似的抗原性，即属 性法氏囊病病毒(IBDV)、减蛋综合征病毒 同一血清型。REV分离株存在3个明显的亚型，可 引起从亚临床感染到生长迟缓、免疫抑制和肿瘤等不 同的临床和病理变化，但对其自然感染造成的经济损 预防兽医学与动物生物技术重点实验室分离并保存。 失还～直估计不足。此外，REV与其他免疫抑制性 1．2主要试剂 疾病的混合感染在鸡群中普遍存在，导致鸡生长缓 Taq Marker 慢，饲料报酬率低和影响免疫效果，给养禽业造成巨 其他限制性内切酶、DNA DL2000等购自大连 大的经济损失。 宝生物工程有限公司；Trizol、质粒DNA提取试剂盒 国内外先后建立了琼脂免疫扩散试验、间接免疫 与胶回收试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有 荧光抗体试验、酶联免疫试验、病毒中和试验、PCR 限公司。其他化学试剂如氯仿、异丙醇、乙醇等，均 法和核酸探针法等。PCR方法检测REV是基于反转为国产分析纯。 录病毒复制周期中，RNA转化为DNA，RNA前病毒1．3引物的设计与合成 DNA插入到宿主DNA中，能够长期存在并垂直传播 给宿主后代。故直接使用组织DNA，由PCR方法直 Premier 接扩增出目的片段。LTR序列由569个核苷酸组成，5．0软件设计合成了2对特异性引物，其中引物Pl、 称长末端重复，在很多细胞是有效的启动子，病毒