山羊转人乳铁蛋白基因成纤维细胞和乳腺上皮细胞单克隆的制备及扩大培养.pdfVIP

安徽农业科学，JournalofAnhuiAgn．Sci．2009，37(31)：15146—15149 责任编辑 陈娟 责任校对 张士敏 山羊转人乳铁蛋 白基 因成纤维细胞和乳腺上皮细胞 单克隆的制备及扩大培养 张玉玲 ，刘凤军 ，张涌 (1．河南科技大学动物科技学院，河南洛阳471003；2．西北农林科技大学生物工程研究所，陕西杨凌 712100) 摘要 [目的】为探索单个转基因阳性细胞快速扩大培养成为细胞克隆的技术体系。[方法]对转染人乳铁蛋白(Humanlactoferrin， hLF)基因乳腺特异性表达裁体pBLM—C1的单个山羊胎儿成纤维细胞 (FetalFibroblasts．FF)和乳腺上皮细胞 (MammaryGlandEpithelia1． MGE)细胞进行克隆。在96孔板中，首先用3种浓度(V／V：0、50％和100％)的适应性条件培养基对单个转染细胞进行细胞单克隆的制 备，进而把转染细胞单克隆与非转染细胞共培养进行扩大培养 ，／leo基因被用于筛选基因，以PCR方法鉴定转染细胞基因组DNA。并对 单克隆细胞进行染色体核型分析。[结果]与非适应性条件培养基相 比，100％适应性条件培养基能够显著提高细胞单克隆存活率；与 对照相比，转染细胞单克隆与非转染细胞共培养，显著提高了转染细胞单克隆扩大培养后 的比率(FF：53．33％ VS．10．00％；MGE： 33．33％VS．6．670％)，且明显缩短了扩大培养汇合时间(20～30d)；PCR鉴定结果表明，上述方法获得的克隆细胞整合有 目的基 因；核型分析表明，大部分细胞克隆染色体正常。[结论]该研究可为分离转基因细胞、理想载体的插入及诊断提供一种可靠的方法，并 能节省转基因动物生产的及费用时间。 关键词 细胞 ；单克隆；扩大培养；转基因；山羊 中图分类号 $82l 文献标识码 A 文章编号 o517—6611(2009)31—15t46～04 ’ SingleColonyPreparation andAmplificationCultureofFetalFibroblastandM ammaryGlandEpithelialCellofHumna Laetoferrni Transgenefrom Goat ZHANGYu-lingetal (CollegeofAnimalScienceandTechnology，HenanUniversityofScienceandTechnoloyg，Luoyang，Henan 471003) Abstract [Objective]Theaimwastoexploretechnicalsystemofmakingsingletransgenicpositivecellsbecomecolonycellsbyamplification culture．[Method]FetalfibroblastsandmammaryglandepithelialceHsofsinglegoatfetusofpBLMC·lwhichspecificallyexpressedhuman laetoferrinwerecloned．Singlecellcolonyofsingletransfectioncellwaspreparedwith3concentrationsofO，50％ and100％ conditionedcul— turo media．Transfectioncellandnon—transfectioncellwerecarriedoutamplificationculturebycon—culture，neogenewasasscreenedgene， genomeDNAoftransfectioncellwasdetectedbyPCRmethod．Chromosomekaryotypeanalysisofsinglecolonycellwastested．[Result]Corn— paredwithnon—conditionedculturemedium．100％ conditionedculturemedium couldgreatlyincrease survivedrateofsinglecolonycells． Comparedwithcontrol，con—cultureoftransfectioncellandnon—transfection