常见免疫学实验技术.doc

常见的免疫学实验技术 主要内容： 实验一 与免疫相关的细胞形态的观察 实验二 沉淀反应 实验三 凝集反应 实验四 溶血反应和补体结合试验 实验五 T、B淋巴细胞分离试验 实验六 豚鼠T淋巴细胞的测定 实验七 酶联免疫吸附试验 实验八 抗原和免疫血清的制备 实验九 血球凝集和血球凝集抑制试验 实验十 白细胞移动抑制试验 实验十一 淋巴细胞转化试验 实验十二 NK细胞活性测定 实验十三 流式细胞仪检测技术 实验十四 杀伤细胞功能的检测 实验十五 吞噬功能试验 附 录 实验一与免疫相关的细胞形态的观察 目的要求： 观察与免疫相关的几种细胞的形态，了解它们在机体免疫反应中的作用。 实验器材： 显微镜 血液涂片(瑞氏染色) 结缔组织切片 方法： 油镜观察 一．血涂片的观察 (A) 红细胞：淡红色，无核的圆形细胞，因红血球为双凹形，故边缘部分染色较深，中心较浅，直径7—8微米。 (B) 颗粒白血球 嗜中性颗粒白血球：体积略大于红细胞，细胞核被染成紫色分叶状，可分1—5叶，核叶之间联以染色质细丝，染色质染成粉色，其中充满细小的大小均匀的颗粒被染成紫红色。直径10—12微米。 嗜酸性颗粒白血球：略大于嗜中白血球，细胞核染成紫色，通常为2叶，胞质充满嗜酸性大圆颗粒，被染成鲜红色。直径10—15微米。 嗜碱性颗粒白血球：体积略小于嗜酸性白血球，细胞质中有大小不等被染成紫色颗粒，颗粒数目较嗜酸性白血球的颗粒少，核为1—2叶染成淡兰色。直径10—11微米。 (C) 无颗粒白血球 淋巴细胞：涂片中可观察到中、小型两种。小淋巴细胞与红血球大小相似，圆形。其中含致密的核，染成深紫色。周围仅有一薄层嗜硷性染成淡蓝的细胞质。中淋巴细胞较大，有较宽层的细胞，核圆形。6-8微米。 单核细胞：体积最大，细胞圆形。胞质染成灰蓝色。核呈肾形或马蹄形，染色略浅于淋巴细胞的核。直径14-20微米。 二．肥大细胞的观察(示教) 胞体较大，呈卵圆形，胞质内充满粗大均等的嗜硷性颗粒。其中含肝素、组织胺等物质。常成群地分布于血管的周围。 三．浆细胞的观察(示教) 细胞呈圆形或卵圆形，胞质丰富，呈嗜硷性。核圆形，着色深，多偏于细胞的一侧，染色质核膜呈车轮分布。正常组织浆细胞少，慢性炎症时增多。浆细胞合成和分泌抗体，对免疫有重要意义。 四．巨噬细胞：又称组织细胞，细胞形态不规则。常伸出短而钝突起，有很强的吞噬能力。 附： 瑞特氏染色： 1．染色液配置 称取瑞特氏染料0.1克溶于60ml甲醇中，过滤。贮褐色瓶中备用。(配置时，要先将瑞特氏染料置研钵体内边研边滴加甲醇，使染料溶液得更好。) 2．瑞特氏染色法： 取小鼠骨动脉血，涂制玻片。干后用玻璃笔在涂处之两侧划线(限制染液流掉)。于划线内部滴加染液3-4滴，经3-5分钟后，再滴加等量的蒸馏水，轻轻晃动混合。经5分钟后，用蒸馏水洗净，待干后用油镜检查。 实验二 沉淀反应 可溶性抗原与相应的抗体混合，在电解质存在的条件下，两者比例适合，即可有沉淀物出现，叫沉淀反应(Precipitation).由于沉淀反应抗原多系胶体溶液。沉淀物主要是由抗体蛋白所组成。 为了求得抗原与抗体的适宜比例，保证有足够的抗体，而且抗原分子小，具有较大的反应面积，因此操作上通常是稀释抗原，不稀释抗体。 沉淀反应的种类有环状沉淀、絮状沉淀、荚膜膨胀、琼脂扩散及免疫电泳等。此外还有放射性同位素标记、酶标记等测定法。 (一)环状沉淀反应 当抗原与相应抗体形成一个接触面时，如二者比例适当，接触面上可形成一个乳白色的环状物即为阳性沉淀反应。 材料： 1. 免疫血清：免疫兔抗人血清 2. 抗原：人血清 3. 小沉淀管、毛细吸管、橡皮头、生理盐水。 方法： 1. 取小沉淀管2只，以毛细吸管吸取抗人血清约0.2毫升，加入第一管，加时注意不能有气泡。 2. 以毛细吸管吸取生理盐水0.2毫升加入第二管。 3. 用毛细吸管吸入血稀释0.2毫升加入各管，加时应注意使抗原溶液缓缓由管壁流下，轻浮于血清面上，使成一明显界面，切勿使之相混。 4. 置室温中10—20分钟，观察液面有无乳白色沉淀环，若有则为阳性。 (二).琼脂扩散试验 琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应。 抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时，便出现可见的白色沉淀线。这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部位形成独立的沉淀线，因此广泛地用于抗原成分的分析。琼脂扩散试验可根据抗原抗体反应的方式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散