运用定点突变提高重组木聚糖酶在毕赤氏酵母中表达.pdfVIP

卷 期 ! ! 微 生 物 学 报 %’ (! . (! 年 月 ## $ !#$ %’()(*(+$ ,-$ )*+*,- ## !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 运用定点突变提高重组木聚糖酶在毕赤氏酵母中的表达 陆 健 曹 钰 陈 坚 （江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室 无锡 1!#73 ） 摘 要：运用 介导的定点突变对米曲霉（ ）来源的木聚糖酶在毕赤酵母中 89: !#$%’(() *%+,-$ 的重组表达进行了研究，获得一表达量远远高于亲本的突变株;13)，对其进行了提纯并研究 其酶学特性，除热稳定性外其余与亲本基本一致。突变株;13) 所产木聚糖酶=?@’ 的分子 量为 ，在 范围内稳定，最适 为 ，最适温度为 ，在 以下稳定性略高 7AB CD ! 5 2 CD E F# !G #G 于亲本。 关键词：重组，木聚糖酶，定点突变，米曲霉，巴斯德毕赤酵母 中图分类号： 文献标识码： 文章编号： （ ） H277 ) ###163#2 ## #!6#!6#3 随着经济和科技的发展，环境和资源问题越来越引起人们的关注，半纤维素中的木聚糖 约占纤维物质的1I 5 7#I 。木聚糖的完全降解需要木聚糖酶和木糖苷酶的协同作用，其 中木聚糖酶（， ， ）以内切方式水解木聚糖分子中的 6 1 !6 6B6J’K? J’K?LMN’K,O P9 7 ( ( 1( $ ! ! 1，糖苷键，是一类重要的半纤维素酶。人们对各种微生物来源的木聚糖酶展开了各方面的 ! ［ ］ 1 5 基础研究，克隆了其中一些并在原核和真核中进行了同源或异源重组表达 。 目前毕赤酵母表达系统是倍受关注的真核表达系统，它不仅具有可诱导的强启动子 （ ），而且外源基因整合于染色体上，可防止重组工程菌的退化，并且具有高密度发酵 )Q=’ 等特点，因而正在成为外源基因表达的常用表达系统。 研究发现，米曲霉（ ）来源的木聚糖酶基因 在毕赤酵母中重组 !#$.’(() *%+,-$ /+01 1 表达时，重组酶的催化活性非常低。本文对重组表达于毕赤氏酵母的木聚糖酶=?@’ 运 用89: 介导的定点突变，提高重组酶的酶活水平，并研究了酶学性质。 ! 材料和方法 ! ! 菌株 大肠杆菌 、巴斯德毕赤氏酵母（ ） （ ）及表达质粒 购 DR1#1 2’34’-#-.*%’ S/’’ LT,! C8;92U 于美国 公司，米曲霉（ ） 日本国税厅酿造研究所保藏， ;.%;0:QSP. !#$%’(() *%+,-$ :;R’$ 分别在 、 、 培养大肠杆菌、酵母和米曲霉。 7E G 7# G 7# G ! # 培养基 培养基：胰蛋白胨（