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微生物工程复习提纲 一、微生物工程概论 微生物产品的四大类型：微生物菌体细胞、微生物细胞的代谢产物（初生和次生代谢）、通过微生物细胞转化的类型（药物、激素）、微生物分泌的蛋白和酶类。 微生物工程的发展简史 1）传统的微生物发酵技术——天然发酵 2）第一代微生物发酵技术——纯培养技术的建立：1.1680年列文虎克发明显微镜，第一个通过显微镜观察到用肉眼看不见的微生物，包括细菌、酵母等。2.1857年法国人巴斯德发现并证明了酒精发酵是由活酵母引起的，各种不同的发酵产物是由不同的微生物产生的。3.1897年德国的毕希纳进一步证明酶对发酵的作用，为微生物工程奠定了牢固的基础。4.十九世纪初德国人科赫首先发明固体培养基，得到了细菌的纯培养物，由此建立了细菌的纯培养技术。 3）近代微生物发酵技术—深层培养技术 4）第三代微生物发酵技术—微生物工程 二、微生物的代谢调节和代谢工程 1. 代谢工程基本思路：根据已有的遗传和生化知识，找出限速步骤，进行遗传操作 2.代谢工程的设计：改变代谢途径，扩展代谢途径，转移或构建新的代谢途径。 三、菌种的来源与选育 1.微生物工程的工业生产水平的决定要素：生产菌种的性能，发酵及提纯工艺条件（发酵工艺的优化和提取工艺的优化），生产设备。其中第一步优良的菌种是最重要的。 2.分离纯化、筛选菌种的一般步骤：调查研究（资料查阅） 试验方案设计 标本采集 标本的预处理 富集培养 菌种初筛 菌种复筛 性能鉴定 菌种保藏 3.标本预处理常用的方法：物理方法：加热、膜过滤、离心等。化学方法：加碳酸钙提高pH值等。诱饵法：将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌落长成后再铺平板。(包括种间、种内及属间)融合为一个新细胞的技术。即实现遗传重组。 准性生殖： 3常用诱变剂：物理诱变剂、化学诱变剂（碱基类似物，与碱基反应的物质、在DNA分子中插入或缺失一个或几个碱基）、生物诱变剂（噬菌体，转座子）。 4.诱变育种的基本过程：选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液 诱变处理 筛选 保藏和扩大培养 P53.(选择) 5.（大题）诱变育种的基本方法：1）出发菌株选择一是考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶系的基因。菌株来源是从自然界中分离得到的野生型菌株；通过生产选育，即由自发突变经筛选得到的高产菌株；已经诱变过的菌株。 其次是出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。 2）制备菌悬液：待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长。悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触，避免出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。 菌悬液的细胞浓度一般控制为：真菌孢子或酵母细胞106(107个/ml，放线菌或细菌108个/ml。菌悬液一般用生理盐水（0.85%NaCl）稀释。 3）诱变处理：诱变剂剂量选择 ：在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。不同微生物，使用的剂量不同；诱变率随诱变剂剂量的增加而提高。但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。诱变剂使用：单一诱变剂处理；复合诱变剂处理 6（大题）原生体的融合技术一般步骤：选择亲株、原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体再生和融合子选择等步骤。（常用的试剂） 方法：1）选择亲株：选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等 2）原生质体制备：去除细胞壁是制备原生质体的关键。培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解。在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性。在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感。菌龄：对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性。 3）原生质体融合：聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合。一般PEG的使用浓度范围在25-40%。采用电融合仪：在高频电场下，用直流电穿孔来进行融合。 4）原生质体再生：使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构。不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，最重要的一个共同点是都需要高渗透压。 5）融合重组子的筛选：通过两亲株遗传标记的互补而得以识别 。如两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B-。 7.基因工程技术的主要步骤 基因工程技术：将一个含有目的基因DNA片段经体外操作与载体