用毕赤酵母系统表达XA21LRR及其糖基化的初步探究.pdfVIP

y 分类号：笾堑 单位代码：!QQ竖 密级： 公西 用毕赤酵母系统表达XA21一LRR 及其糖基化的初步研究 ofXA21一LRRPichia and Expression by pastoris itsinitial of analysisglycosylation 学位申请人：纪洪涛 指导教师：李莉云副教授 刘国振教授 学科专业：植物学 学位类别：理学硕士 授予单位：河北农业大学 答辩日期：二oo六年六月十日 摘要 水稻是一重要的粮食作物，而白叶枯病是危害水稻生长的一种严重的细菌性病 害，水稻遭受白叶枯病后会严重影响产量，因而对水稻抗自叶枯病基因Xa21的抗病 机理研究将对于水稻抵御疾病、增加产量以及解决世界人们的温饱问题具有重要的意 义。己知Xa21编码一个跨膜的类受体激酶蛋白，推测它主要有三个典型的结构域， 即LRR区、跨膜区和激酶区，u渌区是位于膜外的由23个不完全的富含亮氨酸的 重复序列组成，在水稻抗病反应中可能起特异性识别病原菌无毒基因产物AVR的作 用；已有的研究表明水稻中表达的XA21是发生糖基化修饰的(实验室数据未发表)， 可能充当了抗病反应过程中的信号天线的角色，用来识别病原菌的入侵。本研究利用 毕赤酵母表达系统表达XA21蛋白质的膜乡卜LRR区，即利用毕赤酵母分泌型表达载 体构建含有目的基因的重组载体，将重组载体转化到毕赤酵母细胞中，通过营养缺陷 型筛选和G418抗性筛选后，再通过PCR验证重组载体整合到酵母基因组中的情况， 一80℃冻存，最后通过SDS—PAGE及WesternBlot检测上清中目的蛋白的表达情况； 将表达的目的蛋白用糖苷酶PN(hseF处理后做SDS—PAGE或WesternBlot分析，通 过检测经糖苷酶处理后目的蛋白分子量的减少来说明目的蛋白发生了糖基化修饰，后 续的工作可以通过质谱分析确定糖基化位点；本研究首先利用毕赤酵母表达系统的分 泌型表达载体构建了重组载体，然后表达出了XA21蛋白质的膜外结构域LRR区， 通过糖苷酶PNGaseF处理，WesternBlot分析，初步说明LRR区上存在糖链，后续 的工作可以通过质谱来分析目的蛋白上的糖基化位点；本研究通过体外试验初步证明 病菌时糖链的作用机制奠定基础。 关键词：类受体激酶；白叶桔病；糖链；毕赤酵母 ofXA21一LRRPichia anditsinitial of Expression by pastoris analysis Author：Ji Hongtao Supervisor：LiuGuozhen，LilAyun Major：Botany Abstract Riceakind is of white diseaseisaseriousbacterial veryimportantcrop，riceblight diseasewhichinfluencethe ofrice Callevenresultinthelost