双缩脲法总蛋白测定.pptVIP

血清总蛋白测定（双缩脲试剂法） 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验目的 掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； 掌握双缩脲试剂的配制； 熟悉血清总蛋白的临床意义； 了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。 总蛋白测定经典和常见的方法比较 原理-1 两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应 ，生成紫红色络合物。 原理-2 蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。 实验材料 样品：小牛血清 试剂：6.0mol/LNaOH溶液 双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾 双缩脲空白试剂 蛋白质标准液（70g/L） 蒸馏水 器材：试管、烧杯、容量瓶、加样枪、刻度吸管、玻璃棒 设备：1100分光光度计、电子天平、水浴锅 操作步骤 血清总蛋白测定数据处理表 计算 参考范围 正常成人60～80g/L 长久卧床者约低3～5g/L 60岁以上约低2g/L 新生儿总蛋白浓度较低，随后逐月缓慢上升，大约1年后达成人水平。 临床意义 血清总蛋白浓度降低 蛋白质合成障碍 蛋白质丢失增加 营养不良或消耗增加 血浆稀释 血清总蛋白浓度增高 蛋白质合成增加：多发性骨髓瘤 血浆浓缩：脱水、休克 思考题 1.什么叫双缩脲试剂？为什么要在双缩脲试剂中加入酒石酸钾钠和碘化钾？ 2.试剂配制过程中，为何NaOH要单独配制，最后加入？ 3.简述血清总蛋白测定的临床意义。 * 生物化学与分子生物学实验教学中心 * 常用于较纯的酶和免疫球蛋白测定 灵敏度低、干扰物较多 快速简便、无损样品 50～100mg 紫 外 分光光度法 适用于测定单一蛋白质及测定蛋白质含量较少的标本如脑脊液 干扰物质多、操作要求严格计时 灵敏度高、达双缩脲法的100倍。 20～250ug Lowry法 （Folin酚法） 一般用于测定尿液、脑脊液等蛋白质含量较低的样品 影响浊度大小因素多，如加试剂手法、反应温度等 简便、不需特殊仪器 化学比浊法 常用于需求更高呈色灵敏度的蛋白电泳 不同蛋白质与染料结合力不一致，对比色杯有吸附作用 灵敏、简便、快速，干扰因素较少 1～5ug 考马斯亮蓝法 （Bradford） 为临床测定血清总蛋白首选方法。 灵敏度低 特异性高、准确度性好、精密度高、操作简单方便，显色稳定。 1～20mg 双缩脲法 用于标准蛋白质的定值、对其他方法校正等。 操作复杂，费时 准确性好、精密度高、灵敏度高。 0.2～1.0mg氮 凯氏定氮法 适用范围 缺 点 优 点 灵敏度 方 法 小牛血清（1：10） - - 0.5 蛋白标准液（1：10） - 0.5 - 0.9%NaCl 0.5 - - 双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 加入物（ml） B (空白） S 标准） U（待测） 取3支试管，做好标记，按下表操作： 各管混匀，置37℃20min，在波长540nm处比色，以空白管调零，测各管吸光度。 S U 1 2 3 平均吸光度 测定次数 管号