TIRFM在纳粒近壁浓度测量中的应用.docVIP

TIRFM在纳米粒子近壁浓度测量中的应用 王绪伟 李战华( 中国科学院力学研究所非线性力学国家重点实验室，北京 100190 摘要：相比于传统的体照明方式，全内反射（TIRF）照明具有背景干扰小、垂向分辨率高等优点，可用于定量观测液-固界面的流动现象。本文介绍LNM实验室TIRFM系统调试中的技术参数，初步测量了距离玻璃表面500nm高度内?200nm粒子的浓度分布，并与经典的Boltzmann公式进行比较。 引言 Aranuld Serge（2008）[1]利用粒子的细胞表面的受限运动理论绘制了细胞表面形貌的动态变化；郑旭等（2009）[2]使用Micro-PIV实验测量微流道壁面的滑移长度，发现示踪粒子浓度在管道壁面的非线性分布可能引起表观滑移长度偏大。这些现象引起了人们对粒子-壁面相互作用的关注[1-3]，而粒子浓度在近壁区的非均匀分布，也称为depletion layer，是其中的一个基本问题，但是对与近壁粒子浓度的直接测量比较困难。近几年得到迅速发展的全内反射隐失波（TIRF）技术[4]照明范围在距离壁面500nm以内，z向分辨率可达30nm，可有效用于近壁区粒子浓度分布测量。 本文主要介绍了TIRFM测量中的技术问题，并初步使用TIRFM测量距玻璃表面500nm以内的?200nm粒子在纯水中的浓度分布。 TIRF原理及参数调整 TIRF原理 根据Snell透射定律：当光线从介质1进入介质2时，介质的折射率与光线入射角或折射角的乘积守恒（图1L），用数学表示为 (1) 图1 TIRF原理 其中n1和 n2为介质1和介质2的折射率，?1和 ?2分别为光线入射角和折射角。当折射角?2为90o时，没有光进入介质2,称为全反射，相应的入射角称为临界角 (2) 水的折射率n2=1.33，玻璃n1=1.52，可以得到临界接触角?cr为61.4度。对给定的物镜，最大入射角由物镜的数值孔径NA确定 (3) 对100X NA=1.45的油镜，最大入射角为72.5度。 当入射角范围为时，绝大多数光发生全反射，但有一部分光会以平行界面的方向传播，称为隐失波（图1）。TIRF照明厚度内光强I(z)（即隐失波强度）分布为： (4) 其中I(0)为壁面（z=0）处的光强，照明厚度的特征尺度称为穿透厚度dp (5) 其中?为激发光的波长。对532nm激光，对应于不同的入射角，穿透厚度的取值范围为：72～340nm。 入射角与调节器刻度的关系 入射角的大小是由TIRF照明器的调节器控制的。厂家给出的入射角与调节器刻度之间的关系为 (6) 其中a和b分别为光束平行于物镜折射和有一定偏斜折射时的刻度，f为物镜焦距（为3）。但使用中发现，a和b与所使用的实验系统有关。我们重新标定了调节器刻度b与入射角??的关系，如图2所示。 图2 入射角与TIRF调节器刻度b的关系 拟合得到入射角与TIRF调节器刻度b的关系为： sin??=0.38b-7.3 (7) 穿透深度与z向分辨率 根据公式(3)，通过测量粒子光斑的光强I(z)可以得到粒子在z向的位置，从而实现对粒子的三维追踪。根据误差传递，z向定位的误差： (8) 对于粘附在壁面的粒子，光强I0=5000时，?Io=400，可得入射角?=61.4°时，误差?z=31nm。 实验装置与方法 实验装置包括Olympus IX71倒置荧光显微镜，配有数值孔径NA=1.45的100倍TIRF油镜；物镜型TIRF照明器IX2-RFAEVA2（Olympus）；激光器Compass 315M（Coherent）；图像采集用DU885 EMCCD(Andor)。实验用直径200nm的Polystyrene 荧光粒子 (Invitrogen)，粒径的误差2%。在超纯水(Millipore)中稀释至体积分数约为10-5。 荧光粒子的实验溶液配置好后5-10min内开始实验。将约50?L含纳米荧光粒子的溶液滴到载玻片上，液滴的直径约3mm。用CCD记录液滴中的荧光粒子，在bin2模式下图幅为501×502像素，像素尺寸为160nm/pixel。实验示意见图3。在同一平面内，观测5-7个位置，每一空间位置连续拍摄50帧图片，连续两帧的时间间隔Δt为24.05ms,