登革热检测方法.docVIP

附件1：免疫荧光法（IFA）检测IgG抗体　　试验材料：　　（1）DV1～4型抗原片：DV标准毒株感染C6/36或BHK21细胞制备，低温干燥保存；　　（2）对照：登革热患者恢复期血清（阳性对照），非登革热患者血清阴性对照）；　　（3）羊抗人（或兔抗人）IgG荧光素标记抗体；　　（4）常用稀释液：pH7.2～7.4PBS、伊文思兰等；　　（5）荧光显微镜。　　检测步骤：　　（1）用pH7.4，0.02mol/LPBS稀释待检血清，从1：20开始做4倍连续稀释至需要的稀释度。　　（2）取出抗原片，用蒸馏水漂洗后，冷风吹干。　　（3）用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢复期血清），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟（每次试验设阳、阴性对照）。　　（4）用PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗涤1次脱盐，冷风吹干。　　（5）用含1：3万的伊文思兰PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟，然后同（4）洗涤、漂洗、吹干。　　（6）荧光显微镜观察结果。　　 结果判断：　　细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，可将免疫荧光反应大致区分