现代仪器分析--HPLC.pptVIP

第二十二章 高效液相色谱法high performance liquid chromatography 中药化学与分析教研室 本章内容介绍 第一节 概 述 第二节 高效液相色谱仪 第三节 高效液色谱法的基本理论 第四节 各类高效液色谱法 第五节 固定相 第六节 流动相 第七节 HPLC分析条件的选择 第八节 定性与定量分析 第九节 LC-MS联用技术简介 第十节 超临界流体色谱法简介 第一节 概 述 HPLC是在经典液相色谱基础上引入GC的理论和技术,采用： 高速——高压泵 高效——固定相； 高灵敏度——检测器 HPLC与经典液相色谱的比较 高 速： HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。 高 效： 填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。 高 灵敏度： 检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检测器——10-11g。 HPLC 和GC的比较 流动相： HPLC 液体种类多，可选范围多 GC 气体，种类少，改变载气影响柱效和分离少 固定相： HPLC 新型吸附剂，化学键合相，粒度小 GC 吸附剂，担体+吸附剂，粒度大 应用范围： HPLC 高沸点，难挥发，对热不稳定物质 GC 低沸点，易挥发，对热稳定物质 此外，HPLC流出组分可以收集，检测器灵敏度高。 高效液相色谱仪 第二节 高效液相色谱仪 流程及主要部件 process and main assembly of HPLC 主要部件 输液系统 （一） 流动相贮器 耐酸碱的瓶子（棕色或无色），高于泵体，保持输液静压差。 （二）脱气装置 液体流动相使用前要脱气，除去其溶解的气体。 （基线噪音，氧化组分！！） 方法： （1）超声波振动脱气 （2）抽真空脱气 （3）加热回流脱气 （4）吹氦脱气 （5）真空在线脱气 双泵串联补偿法 将两个柱塞杆往复泵串联,泵1比泵2体积大一倍,柱塞杆运动方向相反。 （目的是：减少输液脉冲） (四)梯度淋洗装置 梯度洗脱：分离过程中，随时间函数程序地改变流动相的组成（极性，PH或离子强度）。 类型： 高压梯度 低压梯度 二. 进样系统 三. 色谱分离系统 （二）色谱柱 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 常用的分析柱是内径2～4.6mm，柱长10～25cm （三）柱恒温箱 精确控制柱温可以提高保留时间的重现性。 柱温升高，保留时间减少。 常用温度：室温-65度 （四）色谱柱柱效的评价 《中国药典》05版规定：建立HPLC法时，需要进行“色谱条件与系统适应性”实验。 最佳分离状态下色谱柱应达到的： n理论？ 分离度R？ 拖尾因子T？ 四. 检测系统 检测器：检测器分为溶质性检测器（只对流动相中的被分离分析组分的物理或物理化学性质有响应）和总体型检测器（对流动相的总的物理或物理化学性质有响应）。 （1）溶质性检测器：紫外（UVD）、荧光（FLD）、电化学（ECD）检测器等。 紫外检测器—基于被测组分对特定波长的紫外光的选择性吸收，且吸收符合光吸收定律。因此可以进行定性定量分析。 a．固定波长型检测器—是一种光源波长固定的紫外光度计，一般由低压汞灯作光源，发射波长为254nm波长的光。对在254nm波长附近有吸收的物质有响应。 b．可变波长型检测器—是一台紫外可见分光光度计，波长任意可调。 c. 光电二极管阵列检测器（PDAD） 光电二极管阵列检测器 光电二极管阵列检测器 应用 三维时间-色谱-光谱图 除了定量外，可以综合定性分析: (1)色谱峰的纯度检查 (2) 色谱峰的分离状况 （二）蒸发光散射检测器（evaporative light-scattering detector, ELSD ELSD是基于溶质的光散射性质的检测器。 ELSD属通用型和质量型检测器 由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光光源和光电转换器等部件构成。 检测过程： 流出液 雾化成微细液滴 通过加热漂移管时 溶剂被蒸发掉，留下溶质 激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。 散射光强度正比组分的量 蒸发