羊血液基因组的提取指南.docVIP

1.5 虫体的繁殖与分离以及基因组DNA的提纯 将尤氏泰勒虫，吕氏泰勒虫和羊的巴贝斯虫虫种从液氮取出，并在37℃水浴中迅速解冻后，颈静脉接种实验除脾羊只，当染虫率达到5%以上，静脉采集抗凝血用于虫体基因组DNA的分离提纯；中华泰勒虫接种除脾牦牛，采集染虫血进行虫体基因组DNA的分离提纯。 1.5.1虫体分离 虫体分离的实验方案如图1所示。 1.5.2 虫体基因组DNA提纯 使用DNA Islation Kit for Whole Blood（Gentra公司）试剂盒，按操作说明书，实验方案如下： ⑴ 加300微升BRC Cell Lysis Solution 于盛100微升血液1.5的离心管中，颠倒10次，在室温下放1分钟（新鲜血放置3分钟）。 ⑵ 13000g 离心10分钟，弃上清，保留下面的可见的白细胞沉淀和大约10～20微升液体，涡旋20秒。 ⑶ 每管中加入100微升Cell Lysis Solution，吹打混匀。 ⑷ 加入RNAase 0.5微升，颠倒25次，65℃，15分钟（该步骤选做）。 ⑸ 加入40微升Protein Preciptation Solution。 ⑹ Vertex 20秒，是溶液充分混合。 ⑺ 13000g 离心3分钟。 ⑻ 将上清液移至新标记的离心管中，加入100微升异丙醇，颠倒50次。 ⑼ 13000g 离心10分钟。 ⑽ 弃上清，在干净的纸巾上放置，将剩余的液体吸干。 ⑾ 加入100微升70%乙醇。 ⑿ 13000g离心3分钟，小心除去乙醇。 ⒀ 在吸水纸上吸干剩余液体。 ⒁ 在Speedcac真空干燥。 ⒂ 加入20微升 DNA Hydration Solution。 ⒃ 4℃过夜或60℃温育1小时。 ⒄ 4℃或－20℃保存备用。 1.5.3 青海血蜱基因组DNA的提纯 从青海血蜱中提取基因组DNA的方法与从血中提取基因组的方法基本一致，只是先从固定液中取出蜱，用70%的酒精洗蜱三次，置于干净纸巾上，确定蜱的雌雄。置于Ependorf管的盖子内，用两只12针头将蜱中间切开，再切成4块，然后放入加有100μl cell lysis solution的Ependorf管内，颠倒数次，使所有的组织进入cell lysis solution，盖住管，在管上标记好样品的性别及来源。后面的步骤与虫体DNA的提取完全一致。 血液虫体基因组DNA提取指南： ⑴ 加900微升BRC Cell Lysis Solution 于盛300微升血液1.5的离心管中，颠倒10次，在室温下放1分钟（新鲜血放置3分钟）。 ⑵ 13000g 离心1分钟，弃上清，保留下面的可见的白细胞沉淀和大约10～20微升液体，涡旋20秒。 ⑶ 每管中加入300微升Cell Lysis Solution，吹打混匀。 ⑷ 加入RNAase 0.5微升，颠倒25次，65℃，15分钟（该步骤选做）。 ⑸ 加入100微升Protein Preciptation Solution。 ⑹ Vertex 20秒，是溶液充分混合。 ⑺ 13000g 离心3分钟。 ⑻ 将上清液移至新标记的离心管中，加入300微升异丙醇，颠倒50次。 ⑼ 13000g 离心10分钟。 ⑽ 弃上清，在干净的纸巾上放置，将剩余的液体吸干。 ⑾ 加入300微升70%乙醇。 ⑿ 13000g离心3分钟，小心除去乙醇。 ⒀ 空气干燥5 min。 ⒂ 加入100微升 DNA Hydration Solution。 ⒃ 60℃温育15 min。 ⒄ －20℃保存备用。 台盼蓝染色液 产品简介 通常认为细胞膜丧失完整性，细胞即可被认为已经死亡。台盼蓝是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞，细胞膜完整，能够排斥台盼蓝；而死亡的细胞，膜的完整性丧失，通透性增加，细胞被台盼蓝染成蓝色，很容易与活细胞区分。细胞经台盼蓝染色后，可通过显微镜，直接镜下计数或拍照后计数，实现对活细胞的计数。 台盼蓝染色液(Trypan Blue Staining Solution)采用进口试剂精心配制而成。本产品经过滤除菌，便于储存，使用方便，操作简单，全部操作只需3-5分钟即可完成。 本公司还备有专用细胞稀释液供研发人员选用，以便在细胞密度较高时，用户可以很方便的进行计数细胞的稀释。包装清单 产品编号 380014-T 380014-T1 380014-T2 台盼蓝染色液 5ml 10ml 30ml 说明书 1 份 保存条件 4℃、无菌、密封保存，一年有效。 使用说明 1.收集细胞?? 贴壁细胞 先用胰酶和/或EDTA消化，吹打分散成单个细胞悬液； 悬浮细胞 直接吹打瓶底使成细胞悬液； 收集细胞悬液，用细胞稀释液0-5倍稀释；或离心弃上清，估测细胞数量，向沉淀中定量加入细胞稀释