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RNAi 在干细胞研究中的应用及其进展 摘要??? 在各类生物中，双链RNA（dsRNA）诱导产生特异性基因沉默的机制，被称为RNA干扰（RNAi）。dsRNA干扰技术可通过降解靶基因的mRNA进行基因干涉，是研究多种生物基因功能的有效手段。本文从RNAi相关的Dicer、Agronaute基因家族等来认识其基因沉默必需基因与干细胞功能特性的关系，并综述利用RNAi干扰技术在干细胞研究与应用的进展。 关键词 RNAi 干细胞增殖分化Dicer Agronaute ??? 几十年来，一直认为RNA仅仅从DNA获取遗传信息，并将信息转换成蛋白质。但最近研究发现，小RNA(small RNA)发挥着基因调控的作用。小RNA能关闭基因的表达，或改变基因表达的水平。在发育过程中通过关闭或开放基因的表达，小RNA可能指导着细胞的定向分化并决定细胞的命运[1]。 九十年代初期研究发现21到28个核苷酸的小RNA能抑制植物的基因表达，随后在动物细胞中也发现了这一现象。但直到1998年2月华盛顿卡耐基研究院的Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Mello首次将双链RNA（dsRNA）注入线虫，结果发现诱导了比单独注射正义链或者反义链都要强的基因靶向专一性的基因表达沉默（gene silencing）。他们将这种现象称为RNA干扰（RNA interference ,简称RNAi）。随后许多研究者先后采用不同长度的dsRNA使线虫、果蝇、植物、动物卵细胞和哺乳类细胞等的靶向基因表达明显降低或沉默，因此人们把这种利用dsRNA使目的基因敲低或使目的基因沉默，从而研究目的基因的功能即为RNA干扰技术（RNAi技术。RNA干扰技术由于其独特优点在干细胞研究中备受关注和应用。本文主要综述RNA干扰技术在干细胞研究中的应用及其进展。 一、RNAi的机制及其必需基因1、1 RNAi的机制 ??? 实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23nt小片段RNA即siRNA，后者会使目的mRNA被切割为21-23nt的siRNA。Hammond等人部分纯化了一种RNase Ⅲ型酶（如Dicer等），该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的RNase Ⅲ型酶Dicer识别,切割成21-23 nt的siRNA，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA；识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23nt的siRNA,与Dicer形成复合物即RNA诱导基因表达沉默复合物（RISC），继而RISC特异性地对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。就目前的研究知道在各种生物均存在通过不同长度的dsRNA引起基因表达沉默的RNAi现象。如哺乳动物细胞无论RNA干扰活动,它们都有降解长片段dsRNA产生21-22 nt的siRNA的能力。Tuschl研究则进一步说明甚至在几种更长片段dsRNA不能产生RNAi的哺乳动物细胞中，siRNA依然能够引起基因表达沉默。而在哺乳动物细胞长片段dsRNA不能产生RNAi的原因可能是长于30nt的dsRNA掩敝RNAi的IFN反应的非特异性激活。但Billy研究提示在鼠未分化的EC细胞和ES细胞通过长片段dsRNA诱导RNAi引起特异基因表达沉默。同时Yang的研究显示鼠ES细胞通过siRNA诱导RNAi引起相应目的基因沉默。但通过长片段dsRNA和siRNA引起基因沉默的程度目前仍不清楚。1、2 RNAi的必需基因?? ?通过遗传分析的方法，目前已从线虫中分离到RDE-2，RDE-3和Mut-7等、果蝇中的ago2等、拟南芥中的sgs-2、sgs-3、argonaute1(ago1)、sde1、sde3、caf、ddm-1、met-1等RNAi相关的基因。研究发现这些基因多数属于多基因家族，有很大的保守性。进一步研究发现，许多基因沉默必需蛋白与一些基因表达调控因子结构相似,如拟南芥的DDMI蛋白与染色体再构因子SW12/SNF2相似；拟南芥的MET1是一种维持DNA甲基化转移酶；线虫的RDE-1与翻译因子Eif2C结构相似。这可能表明，基因沉默机制在生物的进化中有很大的保守性和多样性。 二、RNAi 在细胞分裂或分化中的作用??? 通过改变染色体的形状（更紧或更松），能够决定某一个基因表达。近来研究揭示参与RNAi 的siRNA在染色体形状的改变时起着非常重要的作用。这样RNAi 能永久的关闭基因的