传染性法氏囊病新型基因工程疫苗与检测试剂的研究.pdfVIP

传染性法氏囊病新型基因工程疫苗与检测试剂的研究 王永山 江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室 国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 Bursal 传染性法氏囊病(InfectiousDisease，IBD)是引起我国及世界养禽业严重经济损 失的主要传染病之一。疫苗接种是预防该病最有效的方法，在上世纪80年代的中后期，在 世界范围内爆发了在抗原性和致病性等方面与经典毒株有很大差异的IBDV变异毒株，使养 鸡业遭受重创【I巧】。变异株和超强毒株(vvlBDV)的出现使该病的防控难度加大，IBD免疫 预防失败已成为禽病防控中的重要问题。目前，使用的常规弱毒疫苗和灭活疫苗，其安全性 和制造工艺仍存在不足：为预防变异毒株而采用中强毒力活疫苗存在着较大的生物安全问 题，因为在不同IBDV毒株之间潜在着基因重配的可能，给该病的防控带来隐患，灭活疫苗 存在着抗原制备的困难。因此，在当前IBD防控实际工作中，亟需免疫效力强、生物安全 性高、并且针对当前流行毒株的新型IBD基因工程疫苗与检测试剂的问世。 以下是本研究室的近期研究内容： 防失败的病鸡法氏囊组织AHI与AH2中扩增传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因。序 S，具有IBDV强毒的分子特征，用AHI和—蛆{2感染20日龄雏鸡，产生明显IBD病变， 死亡率为25％(1／4)。同源性分析，26个血清I型IBDV毒株VP2基因核苷酸和氨基酸序 核苷酸和氨基酸序列的同源性则分别小于78．6％和83．0％。不同IBDV毒株VP2基因的七肽 基序、特征性氨基酸残基以及高变区的亲水性有差异。在进化树上，26个血清I型IIBDV 毒株可分为数组，其中的15个中国分离IBDV毒株不在同组，毒株之间的亲缘关系与分离 地区或分离时间没有明显的联系。AHl和AH2与现行商品疫苗毒株B87的VP2基因核苷 酸序列差异率分别为5．3％和5．2％；氨基酸序列差异率分别为4．O％和3．4％，这也进一步佐 证了IBDV野毒VP2基因变异所引起的毒力变化和VP2抗原表位的漂移是导致当前IBD疫 苗免疫预防失败的主要原因。本文对认识当前IBDV的流行和变异现状具有参考价值，为新 型IBDV野毒致病性和变异简便定性检测方法探索了一条新途径。 为制备近期IBDV毒株的重组VP2蛋白，将近期安徽IBD免疫预防失败的病鸡法氏囊 组织中扩增的VP2基因定向克隆入原核表达载体pGEX．4T．1中，构建原核表达质粒 检测，呈阳性反应；以SDS．PAGE分析，重组VP2融合蛋白的分子量为68lcu，表达量约占 菌体总蛋白的16．0％，表达产物主要以包涵体形式存在于菌体内；在Western．blotting中， 重组VP2蛋白与IBDV抗体反应形成l条特异性蛋白带。 将2007年12月从安徽境内发生的IBD免疫预防失败的病鸡法氏囊组织中克隆的IBDV DHl0Bac感受态细胞，经三抗性筛选， VP2基因插入到pFastBacI供体质粒中，转化E．coli 细胞，用间接免疫荧光试验(IFA)检测，具有特异性荧光；用IBDV抗体夹心ELISA检测， kDa处出现一条特异蛋 呈阳性反应，抗原效价达到1．6×103：用Western-blotting分析，在53 白条带；电镜观察，重组VP2蛋白能够自组装成病毒样颗粒，在感染细胞中发现了“包涵 体样”结构。用HisTrap唧亲和层析柱纯化的重组VP2蛋白作为包被抗原，建立的IBDV抗 体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。用重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞裂解物， 免疫2周龄SPF鸡，一次免疫14d后，ELISA检测抗体效价为8×102，攻毒实验的保护率 为30％，二次免疫14d后，ELISA抗体效价为3．2xl旷，保护率可达到100％。本实验制备 的针对近期流行IBDV毒株的新型病毒样颗粒重组VP2蛋白在研制新型IBD病毒样颗粒基 因工程疫苗和检测试剂方面显示出了良好的应用前景。 用5株传染性法氏囊病病毒(IBDv)单克隆抗体(mAb)从噬菌体随机肽库中得到了 5个含有不同IBDV抗原表位的模拟肽序列。在此基础上，将5个抗原表位用GGGS四肽连 接构建多表位基因5epis。将该基因合成、克