一种通用高效的复杂载体构建的新方法.pdfVIP

维普资讯 遗 传 HEREDITAS(Beijing)28(2)：212~218，2006 技 术 与 方 法 一 种通用高效的复杂载体构建的新方法 陆云华 ，马立新’，蒋思婧’ (1．湖北大学生命科学 院分子微生物与基因工程实验室，武汉 430062；2．宜春学院生物工程系 ，江西 宜春 336000) 摘 要 ：文章报道 了一种简便、通用、高效的复杂载体构建方法 。此法是在 PCR引物设计时，在 目的片段 5端加上 随机设计的接头，利用 PCR克隆 目的片段 ，再用 T4DNA聚合酶 3一5外切酶活性处理 PCR克隆 目的片段 ，产生多 个首尾相匹配的黏性末端 ，进行多片段定向连接、转化、重组子鉴定。以7片段拼接的水稻单交换质体定点整合表 达载体 pRSMGA的构建为例 ，应用上述方法构建只需做两次连接 、转化 ，且其重组、转化效率高 。数 10次实验证 明：这是一种简便、通用、高效的复杂构建载体 的方法 ，该法至今 尚未见报道 。 关键词 ：复杂载体构建 ；新方法 ；T4DNA聚合酶 ；水稻 中图分类号 ：Q78 文献标识码 ：A 文章编号 ：0253—9772(2006)02—0212—07 A UniversalHigh-throughputNovelMethod OfCOnstruCtingtheVectors LUYun-Hua’ ，MA Li-Xin’，JIANG Si-Jing’ (1．LaboratoryofMoleCularMicrobiologyGeneEngineering，CollegeofLifeScience，HubeiUniversity ，Wul~n430062，China： 2 BiotechnologyDepartmentofYichunUn iversity，Yichun，JiongxiProvmce 33600，hC ina ) Abstract：Inthispaper，asimpleuniversalhigh-throughpulmethodofconstructingthevectorswasdeveloped．Itcould addproperadapterwhenthePCRprimerswerede signed，and the purposefragmentswereclonedbyPCR。and the variouscomplementarystickyendswere createdbyT4DNA polymerase’S3-exodeoxyribonuclease activity．Ifall the sefragmentswereputtogetherwithDNA ligase，theywouldrecombinate inanorientation．Iftheyhadbeentrans- formated，thetansformantswouldbeide ntified．Let’StaketheOryzasativaL．single-crosshomologuo srecombination chloroplastexpression vectorpRSMGA whichwasconstructed with seven fragments asan example。ifthe vector pRSMGAwasconstructedinusing the methodwhathadmentino ed，no lytwicerecombinationand transformationwuo ld bedone．Scoresof experimentshadprovedthat