构建载体个人总结(o.o).docVIP

构建载体 （一）流程图示 根据目标片段设计扩增引物（片段大于1kb时，同时设计测序引物） PCR扩增目标片段 抽质粒载体（扩增外源DNA片段）→检测DNA的质量（琼脂糖凝胶电泳/吸光度）→酶切载体与外源DNA→载体的去磷酸化→连接载体与外源DNA→制备感受态细胞→连接子转化感受态细胞→重组子筛选及鉴定（PCR检测，酶切检测，测序检测） （二）具体步骤及相应原理 质粒抽提 原理 细菌培养物的生长（从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的培养基中，培养至对数生长后期即可）→细菌的收集（离心）及裂解（离子型或非离子型去污剂、有机溶剂、碱处理或加热处理等方法，方法取决于质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后纯化质粒的方法）→质粒DNA的分离和纯化 （1）碱裂解法 solution I ：重悬细菌 solution II：其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞内容物释放出来，NaOH 使DNA变性、碱基对打开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开 solution III： 中和作用，宿主DNA由于很大，碱基还未来得及配就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起沉淀下来，而质粒DNA由于很小且双链未分开，能够迅速配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。 Solution I: Tris.HCl （pH 7.5） 50 m